Peripheral nerve regeneration using hollow and enriched chitosan-based guidance conduits

Periphere Nervenverletzungen stellen ein globales Problem dar, von welchem insbesondere junge Männer in ihren arbeitsfähigen Jahren betroffen sind. Im Zuge von Quetschungen ist eine Wiederherstellung der Funktionalität wahrscheinlich, während die Heilungschancen nach kompletten Nervendurchtrennungen variieren und ein chirurgischer Eingriff erforderlich ist. Falls ein spannungsfreies Verbinden der beiden Nervenstümpfe nicht möglich ist, ist der Einsatz von Nervenleitschienen unerlässlich. In der Klinik wird in diesen Fällen in der Regel ein autologes Nerventransplantat verwendet, welches von einem funktionell entbehrlichen sensiblen Nerven gewonnen wird. Diese Methode hat jedoch Nachteile, da eine zweite Operation nötig ist, das potenziell zu entnehmende Nervengewebe begrenzt ist und es zu Inkompatibilitäten zwischen dem Spender- und Empfängernerv kommen kann. Des Weiteren wird lediglich in der Hälfte der Fälle, welche mit einem Autotransplantat behandelt werden, eine erfolgreiche Regeneration beobachtet. Folglich werden alternative Überbrückungsstrategien für Nervenlücken benötigt. Hierfür wurden bereits verschiedene Synthetik- als auch Biomaterial-basierte Nervenleitschienen getestet und zum Teil auch von der „Food and Drug Administration“ (FDA) sowie „Conformité Européenne“, zu Deutsch „Europäische Gemeinschaft“, zur Behandlung am Menschen zugelassen. Allerdings hat bisher keine dieser Nervenleitschienen eine breite Akzeptanz in der klinischen Anwendung gefunden. Folglich war es ein Ziel dieser Arbeit leere Chitosan-basierte Nervenleitschienen verschiedener Acetylierungsgrade (DAI-III) für die Überbrückung von kleinen Nervendefekten, wie sie z.B. bei Handnerven häufig vorkommen, zu testen. Zu diesem Zwecke wurden Kurzzeit- und Langzeitstudien durchgeführt über Zeiträume von 5 und 18 Tagen, sowie 13 Wochen (Projekt 1). Des Weiteren wurden Chitosan Röhrchen mit einem Hyaluronsäure- und Laminin-basiertem Gel (NVR-Gel) befüllt, in welchem genetisch veränderte neonatale Schwann Zellen suspendiert waren (Projekt 2). Letztere wurden dahingehend modifiziert, dass sie entweder eine erhöhte Expression von GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor) oder der 18kDa FGF (fibroblast growth factor)-2-Isoform aufwiesen. Neben dem reversen autologen Nerveninterponats wurden physiologische sowie mit einem Leervektor-transfizierte Schwann Zellen (in Gel) als Kontrollen transplantiert. Mit der Ergänzung von intraluminalen Leitstrukturen und Schwann Zellen sollte die Behandlung von größeren Nervendefekten, wie sie z.B. für den Plexus brachialis beschrieben sind, angesprochen werden, da diese die Regeneration potenziell unterstützen können. Für beide Projekte wurde das Modell des Nervus ischiadicus bei der Ratte (10 mm oder 15 mm Lücke) gewählt, welches als Standard-Modell zur Untersuchung peripherer Nervenregeneration gilt. Es bietet die Möglichkeit, die motorische als auch sensorische Regeneration u.a. durch elektrophysiologische Messungen, die Feststellung des SSIs (Static Sciatic Index) als auch durch den von Frey Test zu beurteilen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ferner die Gewebereaktion auf das Implantieren der Chitosan-basierten Nervenleitschienen untersucht, um eine starke Abwehrreaktion auszuschließen. Die Ergebnisse, die im Projekt 1 erzeugt wurden waren vielversprechend und eine erfolgreiche, mit dem Autotransplantat vergleichbare, Nervenregeneration konnte für Chitosan Röhrchen aller Azetylierungsgrade, bei einer Überbrückungsdistanz von 10 mm, festgestellt werden. Bei nahezu allen Tieren konnte die Reinnervation distaler Muskeln nachgewiesen werden und die Immunantwort zeigte eine deutliche Reduktion im Zeitverlauf. Letzteres äußerte sich in einer Abnahme aktivierter Makrophagen und multinukleärer Riesenzellen in der fibrösen Kapsel, welche sich um die Chitosan Röhrchen gebildet hatte. Zusätzlich konnte eine Verringerung der Makrophagen im Regenerat beobachtet werde, während die Anzahl der multinukleären Riesenzellen hier im Zeitraum von 18 Tagen bis 13 Wochen unverändert gering blieb. Es ist ferner von Bedeutung, dass die Regulation von beispielhaft ausgewählten Regenerations-assoziierten Proteinen in Spinalganglien und dem Rückenmark durch die Implantation der Nervenleitschienen nach 5 und 18 Tagen nicht beeinflusst wurde. Eine morphometrische Analyse der distalen Nervenabschnitte zeigte jedoch ein erhöhtes Maß an axonalen Verzweigungen für die DAI Gruppe, während die DAIII Röhrchen bereits nach 18 Tagen und verstärkt nach 13 Wochen Risse und Bruchstellen aufwiesen und zum Teil gänzlich auseinandergebrochen waren. Folglich wurden DAII Nervenleitschienen für weitere Experimente ausgewählt, da sie die periphere Nervenregeneration am besten unterstützen. Für Projekt 2 wurden die angereicherten Nervenleitschienen für die Überbrückung einer Distanz von 15 mm getestet. Bis zum Ende der Studie wurden mit dem autologen Nerventransplantat konsequent die besten Ergebnisse erzielt. Lediglich die Gruppe, welche FGF-218kDa überexprimierende Schwann Zellen transplantiert bekommen hatte, zeigte Regeneration in 4 von 7 Tieren. In diesen konnte auch eine partielle Wiederherstellung der Funktionalität gezeigt werden, während dies nur für ein Tier der GDNF sowie physiologischen Schwann Zell Gruppe zutraf. Diese Ergebnisse implizieren, dass die Nutzung von Gel zur Befüllung von Nervenleitschienen nicht die ideale Wahl ist. Möglicherweise fungiert es als physische Barriere und verhindert somit einen erfolgreichen Regenerationsprozess. FGF-218kDa scheint jedoch einen kompensatorischen Effekt zu haben und das axonale Wachstum, auch durch das Gel hindurch, zu ermöglichen. Aus den Resultaten beider Projekte lässt sich folgern, dass DAII Chitosan-basierte Röhrchen eine Alternative für die bereits erhältlichen Nervenleitschienen darstellen um kleine Nervendefekte zu überbrücken. Neben den vielversprechenden Ergebnissen im Rahmen von Projekt 1 besticht dieses Röhrchen durch seine Transparenz. Diese Eigenschaft macht es für den klinischen Einsatz besonders attraktiv, da so die Handhabung für den Chirurgen erleichtert wird und eine schnelle und korrekte Positionierung des Implantates möglich ist. Bezüglich der Behandlung von großen Nervendefekten geht die Suche nach einer idealen, intraluminalen Leitstruktur / Füllung weiter und zusätzliche Experimente sind unerlässlich. Alternativen, welche die Axone leiten ohne den Raum im Röhrchen komplett zu füllen, wie z.B. sehr poröse Schwämme, Membranen oder Fasern, sind demnach vermutlich besser für diese Aufgabenstellung geeignet als Gele.