Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Alternative methods of semen preservation

Rungroekrit, Umaporn

Semen preservation based on simple methods which are suitable for emergency situations and/or can be applied directly in the field is of considerable interest for animal conservation. Therefore, using the pig as an experimental model for endangered species, the main purpose of the present study was to test the possibility of alternative semen preservation without cryoprotectants (CPA) via heat-drying, flame-drying or freezing at -20 °C, and to investigate the fertilization competence of such alternatively preserved spermatozoa after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) into in vitro matured oocytes.   The study includes the evaluation of the effects of the different preservation methods on spermatozoa characteristics (sperm vitality, acrosome status and sperm DNA fragmentation). In this context, effects of short-term (1 - 5 days) and long-term (90 - 100 days) storage on semen specimen were compared, too. Additionally, an evaluation of the different drying and storage durations on the dry weight/moisture content of spermatozoa which had been heat-dried at different temperatures took place.   Spermatozoa were obtained from mature boars (n = 13) and divided into three experimental groups (Group 1: heat-drying, Group 2: flame-drying, Group 3: freezing at -20 °C) for alternative semen preservation without cryoprotectants. Fresh spermatozoa were used as controls.   In the first part of the study, the heat-drying period necessary to reach stability of the semen specimen in relation to their dry weight/moisture content was ascertained (period of drying in a hot air oven at 50 °C, 56 °C, 90 °C or 120 °C).   In the main part of the study a heat-drying period of 45 min was chosen for the temperature range of 50 °C - 90 °C on the basis of these preliminary tests, whereas a heat-drying period of 20 min was selected for the temperature of 120 °C. Flame-drying was performed over a Campingaz® burner (< 2 s). Freezing without CPA in Safe-Lock tube took place in a household freezer at -20 °C.   Heat- and flame-dried specimens were kept in manually evacuated gas tight bags in a refrigerator (4 °C) during short- or long-term storage. In contrast, frozen specimen remained in Safe-Lock tube in the household freezer for storage. For further processing sperm samples were either rehydrated or thawed.   Oocytes, collected from peripuberal gilts at an abattoir, were matured in vitro, and, after reaching metaphase II, were divided into three experimental groups: Group 1 (n = 1,882): ICSI with fresh or alternatively preserved spermatozoa and artificial activation of oocytes, Group 2 (n = 92; control 1): sham injection and artificial activation of oocytes, Group 3 (n = 108; control 2): parthenogenetic (artificial) activation only. Activation was performed with ethanol and cycloheximide in mTCM199 and oocytes were further cultured in vitro for a period of 24 h.   Oocytes showing a second polar body and containing a female and a male pronucleus together with the intracytoplasmic presence of a sperm tail and the disappearance of the injected sperm head were classified as “fertilized”, whereas oocytes containing at least one pronucleus were considered as “activated”. When the male pronucleus was missing after ICSI, the decondensation status of sperm heads was evaluated.   Because ICSI-results largely depend on the technical skills of the operator, skills UR (experimenter 1) was compared those of a highly qualified specialist from a human IVF/ICSI-team (experimenter 2; only fresh spermatozoa).   Within the main part of the study, fresh as well as heat- or flame-dried semen or semen frozen without cryoprotectant was additionally assessed for sperm vitality and the presence of sperm acrosomes was examined via FITC-PNA/PI staining. Since the procedures for alternative semen preservation damage the acrosomes, they were evaluated as “acrosome present” (complete uniform green FITC-PNA fluorescence of the acrosomal cap) or “acrosome absent” (missing acrosome). Finally, the Halomax® Sui test was used for the evaluation of the sperm DNA fragmentation index.   The following results were obtained: After a drying duration of 25 min at 50 °C, 56 °C and 90 °C or of 10 min at 120 °C the dry weight of sperm samples reached stability. Therefore, as mentioned above, the final drying durations of 45 min (for heating at 50 °C, 56 °C and 90 °C) or 20 min (for heating at 120 °C) were chosen for the main experiments. In the main experiments, the dry weight and % MC of sperm samples measured immediately after the drying process lay between 1.0 mg - 2.1 mg and 2.1 % - 4.2 %, respectively, depending on the heating temperature. After short- and long-term storage of the dried samples at 4 °C in a household refrigerator, dry weight and % MC increased in every group [2.1 mg - 2.9 mg vs. 3.0 mg - 3.8 mg and 4.1 % - 5.7 % vs. 6.0 % - 7.6 %, short-term storage vs. long-term storage, respectively (P<0.001)]. As expected, all alternatively preserved spermatozoa proved to be dead, whereas fresh semen contained 98 % vital spermatozoa. After short- and long-term storage of alternatively preserved semen acrosomes were present in 63.7 % - 79.7 % and 52.5 % - 70.3 % of the spermatozoa, respectively. Thus, a significant amount of acrosomes was lost during long-term storage every group (6.4 % - 11.3 %; P<0.05). In contrast, only 10.8 % of the spermatozoa presented a completely green acrosome in fresh semen. The DFI of alternatively preserved semen (except after heat-drying at 120 °C for 20 min) stored for short-term periods reached 30.2 % - 94.5 %, depending on the preservation method. The lowest DFI was measured after flame-drying (30.2 % - 38.0 %), whereas freezing without CPA resulted in 94.5 % DFI. After long-term storage, a further increase of about 5.9 % was seen. The exceptionally low DFI of 1.2 % and 2.3 % after heat-drying at 120 °C for 20 min and short- or long-term storage, respectively, might present an artifact. A DFI of 1.5 % was measured in freshly ejaculated spermatozoa. After in vitro maturation 94.4 % (2,167/2,299) of the oocytes reached metaphase II. The fertilization rate after ICSI with alternatively preserved semen and short-term storage (except after heat-drying at 120 °C for 20 min) reached between 9.4 % - 17.2 %, whereas 5.7 % - 15.5 % fertilized oocytes were obtained after long-term storage. The lowest fertilization rate was obtained from heat-drying at 50 °C for 45 min, whereas the highest fertilization rate was obtained from heat-drying at 56 ° for 45 min. In contrast, after heat-drying at 120 °C for 20 min and short- or long-term storage none of the oocytes was fertilized. A fertilization rate of 18.6 % was obtained in the control group injected with fresh spermatozoa. ICSI results of experimenter 1 and 2 were similar (fertilization rate of 18.6 % and 17.7 %, respectively). After ICSI with fresh or alternatively preserved spermatozoa, but without successful fertilization, 42.0 % - 80.4 % of the oocytes were effectively activated. The activation rate in sham-injected or parthenogenetically activated oocytes reached 71.7 % and 63.0 %, respectively. In successfully activated oocytes without successful fertilization first stages of sperm head decondensation were attained in 29.3 % - 72.3 % of the specimens. The lowest percentage was obtained from frozen semen at -20 °C (short-term storage) and the highest percentage was obtained from heat-drying at 120 °C for 20 min (long-term storage).   It can be concluded that at least low percentages of flame-dried or heat-dried spermatozoa or of spermatozoa frozen at -20 °C without cryoprotectants retain their ability to fertilize after short- or long-term storage when ICSI was used to circumvent critical steps of fertilization.   Although further improvements of these methods will be necessary and successful embryonic and further development has to be demonstrated, simple alternative methods may provide chances for sperm preservation of endangered animals directly in the field or in a nearby human settlement, thereby complementing traditional or more sophisticated semen preservation techniques.

Für den Artenschutz ist es von erheblichem Interesse eine Spermienkonservierung mit einfachsten Mitteln durchführen zu können, die selbst in extremen Notfallsituationen möglich ist und dennoch eine erfolgreiche Fertilisation von Eizellen und eine Weiterentwicklung zu reproduktionsfähigen Nachkommen erlaubt.   Ziel der vorliegenden Studie war es deshalb, zunächst alternative Methoden zur Spermienkonservierung ohne Zugabe von Gefrierschutzmitteln und unter Einsatz einfacher Bedingungen zu prüfen bzw. zu entwickeln sowie die Auswirkungen derartiger Methoden auf verschiedene Spermienparameter näher zu analysieren. In einem zweiten Schritt sollte die Fähigkeit alternativ konservierter Spermien zur erfolgreichen Befruchtung von Eizellen unter Einsatz der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) untersucht werden. Das Schwein wurde als Versuchsmodell für gefährdete Spezies gewählt, da die ständige, tierschutzgerechte Verfügbarkeit von Spermien (Zuchteber) und Eizellen (Schlachthof-material) gewährleistet war.   Spermien befruchtungskompetenter Eber (n = 13) wurden in 3 Gruppen eingeteilt und mithilfe einer der folgenden einfachen Methoden und ohne Zusatz von Gefrierschutzmitteln konserviert: einfache Trocknung der Spermien auf Objektträgern im Wärmeschrank („Wärme-trocknung“) schnelle Trocknung der Spermien auf Objektträgern über einer Flamme („Flammen-trocknung“) Einfrieren der Spermien in Eppendorf Safe-Lock Tubes 500 µL bei -20 ° C. Native Ejakulate der Tiere dienten als Kontrollen.   Die Lagerung der Proben erfolgte je nach Konservierungsmethode entweder im Kühlschrank bei 4 °C oder im Gefrierschrank bei -20 °C. Nach kurzer (1 - 5 Tage) bzw. langer (90 - 100 Tage) Aufbewahrungsdauer und Rehydrierung bei vorausgehender Exsikkation bzw. Auftauen nach früherem Einfrieren wurden die Vitalität der Spermien, das Vorhandensein von Akrosomen und die DNA-Integrität analysiert. Zudem wurde die Befruchtungskompetenz der Samenzellen nach kurzer oder langer Aufbewahrungsdauer unter Einsatz der intracytoplasmatischen Spermieninjektion an in vitro gereiften porcinen Eizellen im Vergleich zu frischen Spermien geprüft.   Im ersten Teil der Studie wurde zunächst die notwendige Exsikkationsdauer bis zum Erreichen einer stabilen Trockenmasse der Spermien bei Wärmetrocknung ermittelt. Hierfür wurden Trocknungstemperaturen von 50 °C, 56 °C, 90 °C oder 120 °C eingesetzt. Basierend auf den erzielten Ergebnissen wurden für den Hauptteil der Studie Trocknungszeiten von 45 min für die Temperaturbereiche von 50 - 90° C und eine Exsikkationszeit von 20 min bei 120 °C ausgewählt. Die schnelle Exsikkation („Flammentrocknung“) erfolgte über der Flamme eines handelsüblichen, transportablen kleinen Gasbrenners (< 2 s).   Die durch Trocknung gewonnenen Proben wurden in gasdichte, vakuumierte Beutel verpackt und bei 4 °C im Kühlschrank gelagert. Im Gegensatz dazu wurden die gefrorenen Proben im Gefrierschrank (-20 °C) aufbewahrt. Für weitere Untersuchungen wurden die Spermienproben je nach Konservierungsmethode entweder rehydriert oder aufgetaut.   Die Eizellen wurden aus Follikeln peripubertärer Schlachtschweine gewonnen, in vitro gereift und nach Erreichen der Metaphase II in drei Versuchsgruppen aufgeteilt. Gruppe 1 (n = 1882): beinhaltete Oozyten bei denen ICSI mit frischen oder alternativ konservierten Samenzellen durchgeführt wurde und eine anschließende artifizielle Aktivierung der Eizellen stattfand. In Gruppe 2 (n = 92; Kontrolle 1) erfolgte eine Simulation der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion in die Eizelle (“Schein-Injektion” ohne Spermium) mit anschließender artifizieller Aktivierung. Die Oozyten der Gruppe 3 (n = 108; Kontrolle 2) wurden dagegen ausschließlich artifiziell, d. h. parthenogenetisch aktiviert. Die Aktivierung wurde mit Hilfe von Ethanol und Cycloheximid in mTCM 199 durchgeführt. Anschließend wurden die behandelten Eizellen für 24 h weiterkultiviert und danach zunächst im vitalen Zustand mikroskopisch kontrolliert. Eine abschließende mikroskopische Beurteilung erfolgte nach Fixation und Färbung.   Als “fertilisiert” wurden Eizellen bezeichnet, die folgende Kriterien erfüllten: Nachweisbarkeit des zweiten Polkörperchens Nachweisbarkeit des männlichen und weiblichen Pronucleus (die Identifikation des männlichen Pronucleus erfolgte anhand der Anwesenheit des Flagellums in der Nachbarschaft des Vorkerns) Fehlen des injizierten Spermienkopfes Im Gegensatz dazu wurden Eizellen, die bloß Vorkerne aufwiesen, als“aktiviert” bezeichnet. Fehlte der männliche Pronucleus nach erfolgreicher ICSI, wurde der Dekondensationsstatus des Kopfes der injizierten Samenzelle ermittelt.   Da ICSI-Ergebnisse stark von den technischen Fähigkeiten der ausführenden Person abhängig sind, wurden die Ergebnisse, die durch die Experimentatorin 1 (Autorin der Dissertations-schrift), die sämtliche Versuche im Rahmen der vorliegenden Studie durchgeführt hatte, erzielt wurden, mit Kontrollergebnissen einer hochqualifizierte Person eines IVF-/ICSI-Teams (Experimentator 2) verglichen.   Weiterhin wurden im Hauptteil der Studie sowohl native als auch alternativ konservierte Samenproben im Hinblick auf die Spermienvitalität untersucht. Zusätzlich erfolgte die Analyse der Spermien bezüglich der Anwesenheit/des Fehlens des Akrosoms mittels FITC-PNA/PI-Färbung. Da die Akrosomen durch die alternativen Samenkonservierungsvorgänge geschädigt wurden, leuchtete im Falle ihrer Anwesenheit die komplette akrosomale Kappe in grüner Fluoreszenz (Einstufung als “Akrosom vorhanden”). Bei Ausbleiben einer entsprechenden Fluoreszenz und infolgedessen einem roten Aufleuchten des kompletten Spermienkopfes fehlte dagegen das Akrosom bei den durch die alternativen Konservierungsvorgänge nicht mehr vitalen Spermien (Einstufung als “Akrosom fehlt”). Letztendlich kam der Halomax® Sui Test zum Einsatz, welcher Aufschluss über den DNA-Fragmentationsindex (% DFI) geben sollte.   Folgende Ergebnisse wurden ermittelt:   Nach einer Exsikkationsdauer von 25 min bei 50 °C, 56 °C und 90 °C oder von 10 min bei 120 °C zeigten die Spermienproben ein stabiles Gewicht. Deshalb wurde die bereits oben erwähnte Trocknungszeit von 45 min bei 50 °C, 56 °C und 90 °C bzw. 20 min bei 120 °C für die alternative Spermienkonservierung gewählt.   In den Hauptversuchen wurde das Trockengewicht und der Feuchtigkeitsgehalt der Spermaproben nach Wärmetrocknung sofort nach dem Exsikkationsprozess ermittelt und lag, abhängig von der Trocknungstemperatur, zwischen 1.0 mg - 2.1 mg bzw. 2.1 % - 4.2 %. Nach Kurz- und Langzeitlagerung dieser getrockneten Proben bei 4° C im Kühlschrank, erhöhten sich sowohl das Trockengewicht als auch der Feuchtigkeitsgehalt in jeder Exsikkationsgruppe (Kurzeitlagerung: 2.1 mg - 2.9 mg bzw. 4.1 % - 5.7 %; vs. Langzeit-lagerung 3.0 mg - 3.8 mg bzw. 6.0 % - 7.6 %; P < 0.001)   Wie erwartet waren alle alternativ konservierten Spermien nach Rehydrierung oder Auftauen tot. Das native Ejakulat enthielt demgegenüber 98 % vitale Spermatozoen.   Nach der Kurzzeit- bzw. Langzeitlagerung der alternativ konservierten Spermien war das Akrosom bei 63,7 % - 79,7 % bzw. 52,5 % - 70,3 % der Spermien vorhanden. Nach Langzeitlagerung wurde dagegen in jeder Gruppe ein signifikanter Verlust an Akrosomen im Vergleich zu den nur für eine kurze Zeitperiode aufbewahrten Spermien festgestellt (6,4 % - 11,3 %; P < 0.05). Kontrollspermien im frischen Ejakulat wiesen nur zu 10,8 % ein komplett grün fluoreszierendes Akrosom auf. Der DFI der kurzfristig gelagerten, alternativ konservierten Spermien (Ausnahme: Spermien nach Wärmetrocknung bei 120 °C) erreichte, abhängig von der Konservierungsmethode, einen Wert von 30,2 % - 94,5 %. Der niedrigste % DFI wurde nach Flammentrocknung der Spermien festgestellt (30,2 % - 38,0 %). Im Gegensatz dazu wurde bei Spermien, die ohne Kryoprotektion eingefroren worden waren, der höchste DFI von 94,5 % gemessen. Nach der Langzeitlagerung wurde ein Anstieg des DFI von 5,9 % diagnostiziert. Ein außergewöhnlich niedriger DFI von 1,2 % und 2,3 % wurde nach Wärmetrocknung bei 120° C für 20 min und anschließender Kurzzeit- bzw. Langzeitlagerung beobachtet, der möglicherweise als Artefakt zu interpretieren ist. Im frischen Ejakulat wurde ein DFI von 1,5 % festgestellt.   Nach der In-vitro-Maturation erreichten 94,4 % (2167/2299) der Eizellen die Metaphase II.   Die Fertilisationsrate nach ICSI mit alternativ konservierten, kurzfristig gelagerten Spermien (außer Wärmetrocknung bei 120 °C für 20 min) erreichte einen Wert von 9,4 % - 17,2 %. Nach Langzeitlagerung der Samenzellen lag dieser Wert bei 5,7 % - 15,5 %. Die niedrigste Fertilisationsrate wurde nach Wärmetrocknung bei 50° C für 45 min festgestellt, wohingegen der höchste Prozentsatz nach Wärmetrocknung bei 56° C für 45 min zu ermitteln war. Spermien, die bei 120°C für 20 min getrocknet worden waren, stellten eine Ausnahme dar, denn nach ICSI wurden die Oozyten weder nach Kurz- noch nach Langzeitlagerung erfolgreich befruchtet. Demgegenüber wurde in der Kontrollgruppe nach ICSI mit frischen Spermien eine Fertilisationsrate von 18,6 % erzielt.   Die durch die Experimentatoren 1 und 2 erzielten ICSI-Ergebnisse mit frischen Spermien waren ähnlich (Fertilisationsrate von 18,6 % bzw. 17,7 %).   Nach ICSI mit frischen oder alternativ konservierten Spermatozoen, jedoch mit erfolgloser Fertilisation, wurden 42,0% - 80,4 % der Eizellen erfolgreich aktiviert. Die Aktivierungsrate nach ICSI-Simulation („Schein-Injektion“; Kontrolle 1) oder Parthenogenese-Induktion (Kontrolle 2) lag bei 71,7 % bzw. 63,0 %.   Bei den erfolgreich aktivierten, jedoch nicht fertilisierten Eizellen war eine beginnende Spermienkopfdekondensation in 29,3 % - 72,3 % der Fälle nachweisbar. Der niedrigste Wert wurde nach Einfrieren der Spermien bei -20 °C (Kurzeitlagerung) erreicht und der höchste Wert nach Wärmetrocknung bei 120° C für 20 min gemessen (Langzeitlagerung).   Zusammenfassend ist festzustellen, dass eine Befruchtungskompetenz nach ICSI zumindest bei einem niedrigen Prozentsatz der alternativ konservierten Spermien sowohl nach Kurzzeit- oder Langzeitlagerung erhalten bleibt. Dies betrifft sowohl die Wärme- und die Flammentrocknung als auch die Gefrierkonservierung bei -20 °C ohne Kryoprotektion. Obwohl weitere Verbesserungen dieser Methoden notwendig sind, um eine erfolgreiche Befruchtung und mögliche Weiterentwicklung der Embryonen zu gewährleisten, stellen solche einfachen Vorgehensweisen in Zukunft möglicherweise eine Chance dar, Spermien bedrohter Tierarten auch unter widrigsten Bedingungen unter Zuhilfenahme einfachster technischer Möglichkeiten zu konservieren. Derartige Methoden könnten so zu einer sinnvollen Ergänzung anspruchsvoller Konservierungstechniken werden.



Rungroekrit, Umaporn: Alternative methods of semen preservation. Hannover 2014. Tierärztliche Hochschule.


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