Isolierung, in vitro Kultivierung und Charakterisierung von keimbahnspezifischen Stammzellen beim Schwein

Die ersten im Säugerorganismus auftretenden Keimzellen sind die Vorläuferkeimzellen; sie bilden damit den Ursprung der männlichen Keimbahn. Aus ihnen entwickeln sich im Laufe der Embryonalentwicklung die Gonozyten. Diese sind dann bis zu 4 Monate post natum im Hoden nachweisbar. Wandern die Gonozyten aus der Mitte der Tubuli seminiferi an die Basalmembran werden aus ihnen die spermatogonialen Stammzellen. Sie bilden den Ursprung der Spermatogenese im adulten Organismus. Die keimbahnspezifischen Stammzellen geben einerseits genetische Informationen direkt an die nächste Generation weiter und stellen damit ein primäres Ziel für genetische Modifikationen dar und andererseits können sie in der regenerativen Medizin zur Behandlung und Erforschung der Unfruchtbarkeit eingesetzt werden. Da es bisher nur von Nagetieren etablierte Linien spermatogonialer Stammzellen gibt, diese aber für die Beantwortung vieler Fragestellungen ungeeignet sind, ist es notwendig auch von Nutztieren diese Linien zu etablieren. Voraussetzung dafür ist ein funktionierendes in vitro Kultursystem. Da das Schwein eine hohe physiologische und anatomische Ähnlichkeit mit dem Menschen aufweist, ist es für die Beantwortung einiger Fragestellungen besonders gut geeignet. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es deshalb, keimbahnspezifische Stammzellen aus juvenilen und adulten Schweinehoden zu isolieren und ein in vitro Kultursystem zu etablieren. Dazu wurden zunächst die drei Kulturmedien KSOM, MEM α und StemPro-34 verwendet und miteinander verglichen. Zu diesem Zweck wurde an Tag 1, 4, 7 und 20 der in vitro Kultur die Vitalität der kultivierten Zellen mit Hilfe von Trypan Blau bestimmt. Dabei zeigte sich, dass in beiden Altersgruppen in allen Medien die Vitalität im Laufe der Zeit abnahm. Die höchste Vitalität und Proliferation konnte tendenziell bei juvenilen und adulten testikulären Zellen im StemPro-34 Medium beobachtet werden. Vor der weiteren in vitro Kultur wurde zunächst die Ausgangsdichte der ausgesäten Zellen optimiert. Bei den juvenilen testikulären Zellen erwies sich eine Ausgangsdichte von 60.000/cm2 als am besten geeignet. Allerdings wurde bei der mikroskopischen Beobachtung festgestellt, dass die juvenilen testikulären Zellen sehr stark proliferierten und es deshalb nötig war, die Kulturplatten nach einer gewissen Zeit zu spülen und den Überstand auf einer neuen Kulturplatte weiter zu kultivieren. Für dieses Verfahren war das Spülen der Kulturplatten nach 2h bei einer Ausgangsdichte von 150.000/cm2 am besten geeignet. Im Gegensatz dazu konnte bei den adulten testikulären Zellen nur eine sehr geringe Proliferation beobachtet werden. Deshalb war hier eine höhere Ausgangsdichte von 200.000/cm2 am besten zur in vitro Kultur geeignet. Als nächstes wurden die Zellen aus den drei Ausgangsmedien mit Hilfe der RT-qPCR und Immunfluoreszenzfärbungen näher charakterisiert. Dafür wurden Markergene gewählt, die spezifisch für keimbahnspezifische Stammzellen (PGP 9.5/UCHL-1), spätere Stadien der Keimzellen (VASA), Leydigzellen (LHCGR), Sertolizellen (GATA4) und für Zellen der glatten Muskulatur (ACTA2) waren. Dabei zeigte sich in beiden Altersgruppen in MEM α die höchste Expression von PGP 9.5. Allerdings konnte bei den adulten testikulären Zellen durch den Zusatz von 10% FCS zu KSOM auch in diesem Medium eine höhere PGP 9.5 Expression nachgewiesen werden, deshalb war davon auszugehen, dass auch der höhere Anteil von PGP 9.5 positiven Zellen im MEM α Medium gegenüber StemPro-34 im höheren Serumanteil begründet war. Deshalb und auf Grund der Ergebnisse der Trypan Blau Färbung sowie der morphologischen Beobachtungen wurden zur Optimierung der Kulturbedingungen Wachstumsfaktoren (GDNF und IGF-1) und Hormone (FSH und Testosteron) in unterschiedlichen Konzentrationen dem StemPro-34 Medium zugesetzt. Die Auswirkungen der verschiedenen Kulturzusätze auf die in vitro Kultur von juvenilen und adulten testikulären Zellen wurden wieder mit Hilfe der RT-qPCR und Immunfluoreszenzfärbungen mit dem gleichen Markerpanel analysiert. Leider hatte keiner der getesteten Kulturzusätze einen positiven Einfluss auf die Expression von PGP 9.5 in der in vitro Kultur von juvenilen und adulten porcinen testikulären Zellen. Im letzten Teil der Arbeit wurden zwei Methoden (Differentielles Plattieren und Dichtegradientenzentrifugation) zur Anreicherung der keimbahnspezifischen Stammzellen von juvenilen und adulten Tieren eingesetzt und optimiert. Beim Differentiellen Plattieren wurde das Anheftungsverhalten der verschiedenen Zellpopulationen an der Kulturplatte nach 16-18h (über Nacht), 3 Tagen und 11 Tagen mit Hilfe der RT-qPCR untersucht. Außerdem wurde dabei der Einfluss des Serumanteils (1% und 10%) im Medium beurteilt. Dabei zeigte sich, dass sich bei den juvenilen testikulären Zellen die somatischen Zellen sehr schnell an der Kulturplatte anhefteten und die Expression von PGP 9.5 im Laufe der Zeit auf der Kulturplatte gegenüber dem Überstand zu nahm. Im Gegensatz dazu war bei den adulten testikulären Zellen kaum ein Anheften der verschiedenen Zellpopulationen zu sehen. Die Ausnahme bildeten in diesem Fall die Zellen der glatten Muskulatur. Bei beiden Altersgruppen hatte der Serumanteil im Medium keinen Einfluss auf das Anheftungsverhalten der unterschiedlichen Zellpopulationen. Auf Grund dieser Ergebnisse erwies sich das Differentielle Plattieren bei adulten testikulären Zellen als nicht praktikabel um SSCs anzureichern. Nach der Optimierung der Bedingungen für die Dichtegradientenzentrifugation mit Percoll wurden für die juvenilen testikulären Zellen Percollkonzentrationen von 20%, 23%, 27%, 30% und 40% und für die adulten testikulären Zellen Percollkonzentrationen von 20%, 30%, 40% und 50% eingesetzt. Unter diesen Bedingungen entstanden dann 4 bzw. 3 Fraktionen. Diese wurden mit Hilfe der RT-qPCR und Immunfluoreszenzfärbungen untersucht. Bei den juvenilen testikulären Zellen war in den Fraktionen 1 bis 3 eine Anreicherung von PGP 9.5 positiven Zellen gegenüber der Ausgangszellpopulation zu beobachten. Bei den adulten testikulären Zellen war hingegen in keiner der drei Fraktionen eine Anreicherung der spermatogonialen Stammzellen zu beobachten. Aus diesem Grund wurden auch nur die angereicherten Fraktionen der juvenilen testikulären Zellen für die weitere in vitro Kultur verwendet. Wegen der Beobachtung von SSC ähnlichen Zellen bzw. Kolonien im StemPro-34 Medium und der hohen Vitalität und hohen Anzahl lebender Zellen wurde dieses Medium neben MEM α zur Kultivierung der angereicherten Zellpopulationen eingesetzt. Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbung zeigten, dass bei der in vitro Kultur von Fraktion 2 in MEM α die meisten Gonozyten vorhanden waren. Dabei ist aber zu beachten, dass MEM α 10% FCS und StemPro-34 nur 1% FCS enthielt. Um also beurteilen zu können, ob dieser Effekt auf dem höheren Serumanteil beruhte oder nicht, müsste man beide Medien mit dem gleichen Serumanteil einsetzten und miteinander vergleichen. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen noch die Schwierigkeiten bei der Etablierung eines in vitro Kultursystems für porcine keimbahnspezifische Stammzellen. Die detaillierte Analyse der genauen Zusammensetzung der testikulären Zellpopulation in vitro in den drei Kulturmedien und des Anheftungsverhaltens der verschiedenen Zellpopulationen gibt aber erste Hinweise, die bei der Entwicklung eines solchen Systems sehr hilfreich sein können. So ist es z.B. notwendig, den genauen Einfluss des Serums und den weiterer Kulturzusätze auf die keimbahnspezifischen Stammzellen zu untersuchen. Dazu könnte bei den juvenilen Stammzellen die hier etablierte Anreicherung mittels Percoll oder eine Kombination aus beiden hier verwendeten Anreicherungsmethoden eingesetzt werden.