Investigation of the junctional complex at the blood-testis barrier in SCCx43KO mice and establishment and functional characterization of a murine sertoli cell line deficient of connexin43

Gerber, Jonathan

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Investigation of the junctional complex at the blood-testis barrier in SCCx43KO mice and establishment and functional characterization of a murine sertoli cell line deficient of connexin43

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In der SCCx43KO (Sertolizell-spezifischer-Connexin43-Knockout) Mauslinie fehlt das Gen Gja1, das für das Protein Connexin43 (Cx43) codiert, sodass dies in der Sertolizelle (SZ) der Knockout-Maus nicht exprimiert wird. Connexine (Cx) sind die Proteinbestandteile der Gap-Junction-(GJ)-Kanäle. Alle GJ-Kanäle werden von jeweils zwei Connexonen benachbarter Zellen gebildet, die wiederum aus jeweils sechs Cx zusammengesetzt sind. Ein Cx ist ein Viertransmembranprotein mit zwei extrazellulären Schleifen, einer intrazellulären Schleife und intrazellulär lokalisierten N- und C-terminalen Enden. Innerhalb des Keimepithels befinden sich aus Cx43 aufgebaute GJ-Kanäle zwischen benachbarten SZ und zwischen SZ und Keimzellen. Diese Kanäle ermöglichen die direkte Kommunikation zwischen benachbarten Zellen. So ist Cx43 am Aufbau der Blut-Hoden-Schranke (BHS) zwischen benachbarten SZ beteiligt und es wird angenommen, dass Cx43 die dynamische Regulierung dieser Barriere unterstützt. Dennoch sind die Funktionen dieser Junction-Proteine und die dynamische Regulierung der BHS noch nicht eindeutig erklärt. Eine funktionelle BHS ist essentiell für die Spermatogenese und sie unterteilt das Keimepithel in ein basales und ein adluminales Kompartiment. So entsteht im adluminalen Kompartiment, das die haploiden Keimzellen enthält, ein spezielles Milieu, in dem die Zellen vom körpereigenen Immunsystem geschützt sind. Es wird außerdem angenommen, dass Cx43 die Reifung der Keimzellen während der Spermatogenese durch ihre GJ-Kanäle mit den SZ unterstützt. Neue Studien zeigen eine Verknüpfung zwischen GJ- und Tight-Junction (TJ)-Proteinen. Die TJ etablieren sich zu Beginn der Pubertät und bilden die Grundlage der BHS zwischen benachbarten SZ. Insbesondere das Fehlen von Cx43 in SZ bewirkt eine Hochregulation zahlreicher TJ-Proteine (zum Beispiel Occludin und Claudin11). Daher ist die SCCx43KO-Mauslinie ein ideales Modell für die Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Cx43 und TJ an der BHS im männlichen Keimepithel. Den männlichen SCCx43KO-Mäusen fehlt das Cx43 in den SZ und sie sind infertil, während die SCCx43KO-Weibchen fertil sind. Darüber hinaus ist bekannt, dass sowohl einige Männer mit testikulären Carcinoma in situ (CIS) als auch Männer mit gestörter Spermatogenese eine Herunterregulation des GJ-Proteins Cx43 in den SZ und den Keimtubuli aufweisen. Dieses Protein ist ein wichtiger Bestandteil der BHS und kann möglicherweise eine Rolle bei der Entwicklung eines männlichen Verhütungsmittels spielen. Hierbei könnte die Funktion der GJ-Kanäle durch Pharmaka reversibel gehemmt werden und somit als Schalter dienen, um die Spermatogenese reversibel an- oder auszuschalten. In der vorliegenden Arbeit wird die Regulation der TJ-Proteine in An- oder Abwesenheit des Proteins Cx43 untersucht, wobei folgende Fragen beantwortet werden sollen: (1) Wie und wo ist das TJ-Protein Occludin in SCCx43KO und Wildtyp (WT)-Mäusen während der Pubertät an der BHS exprimiert und lokalisiert? (2) Welche Unterschiede gibt es zwischen primären SCCx43KO und WT SZ-Kulturen? Wie wird die Expression des TJ-Proteins Claudin11 in zuvor etablierten und charakterisierten primären SZ-Kulturen (SCCx43KO und WT) reguliert? Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mittels Immunhistochemie (IHC), semi-quantitativer Western Blot (WB)-Analyse und Real-Time-quantitativer-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) das Expressionsmuster von Occludin in der SZ untersucht. Dazu wurden sowohl prä- und peripubertäre sowie adulte SCCx43KO- und WT-Männchen der etablierten transgenen Mauslinie miteinander verglichen. Ziel war es, den möglichen Einfluss von Cx43 auf das Expressionsmuster und die Regulierung von Occludin zu untersuchen. Das Gen Gja1, welches für Cx43 codiert, fehlt nur in der SZ dieser KO-Mäuse, was zu einer gestörten Spermatogenese führt. Die qRT-PCR zeigt einen mRNA-Anstieg von Occludin in adulten SCCx43KO-Mäusen. Diese Ergebnisse entsprechen der gesteigerten Occludin-Proteinsynthese im Hoden von erwachsenen SCCx43KO-Mäusen. Zusätzlich wurde mittels IHC eine während der Pubertät um einen Tag verzögerte Expression von Occludin in der BHS bei SCCx43KO-Mäusen zwischen Tag 10-12 postpartum (p.p.) nachgewiesen. Außerdem konnte ein signifikanter Anstieg der Genexpression von Occludin und Claudin11 in adulten männlichen SCCx43KO festgestellt werden. Diese Studie zeigt sowohl zeitliche als auch räumliche Veränderungen in der Proteinexpression von Occludin, was darauf hinweist, dass Cx43 möglicherweise als Regulator für die Occludin-BHS-Bildung dient und für deren Funktion verantwortlich ist. Die SCCx43KO und WT-Mäuse sind darüber hinaus ein ideales Modell, um weitere Einblicke in die mechanistische GJ-Bildung in der SZ zu gewinnen. Es wurde mit Hilfe von PCR, IHC und Immunfluoreszenz (IF) erfolgreich eine modifizierte Methode für die Entwicklung von primären SZ-Kulturen etabliert und validiert. Primäre SCCx43KO- und WT-Zellkulturen waren morphologisch vergleichbar und zeigten eine ~ 98 %ige Reinheit. Diese hochreinen SZ-Kulturen wurden daraufhin an Tag 4 der Kultur auf Lebensfähigkeit untersucht, wobei keine Unterschiede zwischen WT- und SCCx43KO-Kulturen festgestellt wurden. Zusätzlich wurde der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) gemessen. Die Ergebnisse deuten auf eine Zunahme der TJ in den SCCx43KO-Kulturen von SZ hin. Mittels semi-quantitativem WB wurde ein Trend zur Erhöhung des TJ-Proteins Claudin11 in SCCx43KO-Zellkulturen und eine signifikante Erhöhung im Hodenhomogenat erwachsener SCCx43KO-Mäuse im Vergleich zum WT festgestellt. So kann künftig eine defiziente Cx43 SZ-Zelllinie als wertvolles in vitro Werkzeug eingesetzt werden, um nicht nur ein besseres Verständnis der Rolle von Cx43 während der Spermatogenese und im Auf- und Abbau der BHS zu erlangen, sondern auch um Informationen für die Behandlung männlicher Unfruchtbarkeit, verursacht durch eine eingeschränkte Spermatogenese, zu erhalten. Es können einerseits durch die Verwendung der SCCx43KO und WT-Mäuse und durch zusätzliche ex vivo Studien weitere Informationen über die Regulierung der BHS durch andere TJ-Proteine in An- oder Abwesenheit von Cx43 erarbeitet werden. Andererseits kann die Entwicklung einer immortalisierten Zelllinie von SCCx43KO und WT Mäuse zusätzlich weitere Einblicke in die komplexe Kommunikation zwischen SZ geben. Diese Modelle sind außerdem für weitere Studien zur männlichen Infertilität, zu Hodentumoren und zu männlichen Kontrazeptiva geeignet.

The Sertoli cell specific connexin43 knockout (SCCx43KO) is a transgenic mouse line in which the gene Gja1, coding for connexin43 (Cx43) is knocked out only in the Sertoli cells (SC). The protein Cx43 forms a gap junction (GJ) channel. All GJ channels are composed of two connexons from neighboring cells, with each connexon being composed of six connexins (Cx). A Cx is a four transmembrane protein with two extracellular loops, while an additional loop and both N- and C-terminal domains are located intracellularly. Within the testes, the GJ channel Cx43 is located between SC and between SC and germ cells (GC). These channels allow for direct cytoplasmic communication between the adjacent cells. Cx43 is present at the blood-testis barrier (BTB) between two neighboring SC and is believed to aid in the dynamic regulation of this barrier. Nevertheless, these GJ proteins are structures whose function and dynamic regulation is still poorly understood. The BTB is vital for spermatogenesis; its formation separates the seminiferous tubules into a basal and adluminal compartment. This creates a unique lumen milieu (for haploid GC) which is protected from the immune system. While being localized between the SC and GC, Cx43 is believed to nurture and aid the GC (spermatogonia and spermatocytes) in their proliferation and maturation process during spermatogenesis. Recent studies have begun linking regulations between GJ and tight junction (TJ) proteins. These TJ proteins create the BTB between SC, which initiates formation at the beginning of pubertal development. In particular a lack of Cx43 within the SC causes an upregulation of the numerous TJ proteins (e.g. occludin and claudin11). Hence, the SCCx43KO mouse is an ideal model to study the link between Cx43 and TJ expression and assembly. It has been well established that Cx43 is the key GJ in the SC. Its absence has led to infertility of the male SCCx43KO mice. Additionally, Cx43 has been shown to be significantly downregulated in some men expressing seminiferous tubules with spermatogonial arrest or carcinoma in situ (CIS). Recent publications have stated that the BTB is an ideal target for studying male contraceptives. In particular, reversible alterations made to the BTB’s junctional complex may act as a switch for turning spermatogenesis on or off. Through establishment of two SC cultures from wild type (WT) and SCCx43KO mice, researchers could have access to a larger experimental field, not be limited by breeding constraints and the high cost of maintaining a mouse line. The regulation of TJ compared in mice and primary SC cultures with and without Cx43 is the basis for the two studies described in this thesis: (1) How is the expression of the TJ protein occludin affected at the BTB during puberty in comparing SCCx43KO and WT littermates? (2) Are there differences when culturing SC from SCCx43KO mice and their WT littermates? How is the expression of the TJ protein (specifically claudin11) affected when comparing the SCCx43KO and WT primary SC cultures? In the first part of the study, the expression pattern of the testicular TJ protein occludin was analyzed in SC. This was performed using immunohistochemistry (IHC), semi-quantitative Western blot (WB) analysis and quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) using the established transgenic SCCx43KO mice and their WT littermates. Both adolescent to adult SCCx43KO and WT males were compared. The goal was to elucidate a possible role of Cx43 on the expression pattern and regulation of occludin. The qRT-PCR indicates an increase in occludin and claudin11 messenger ribonucleic acid (mRNA) in adult SCCx43KO mice testes, while Cx43 was significantly downregulated. These results correspond to testicular occludin and claudin11 protein synthesis of adult mice. Yet, no significant difference of occludin protein synthesis between WT and SCCx43KO were determined between day 8 and 15 postpartum (p.p.) testes using semi-quantitative WB. Still, during puberty a one day delayed shift of occludin immunoreaction to the BTB region occurred in SCCx43KO males between day 10-12 p.p. This study demonstrates spatio-temporal alterations in occludin, indicating that Cx43 might act as a regulator for BTB formation and function. This first study was been published in GERBER et al. 2014. In the second part of the study, the SCCx43KO mouse line seems ideal to gain further insight into the mechanistic GJ (and TJ) formation in SC and the seminiferous epithelium; however experiments in the past were limited to an in vivo model. A slightly modified method for developing primary SC cultures was established, validated and successfully characterized via polymerase chain reaction (PCR), IHC and Immunofluorescence (IF). It was evident that both SCCx43KO and WT primary cell cultures were similar in morphology and contained ~ 98 % SC. These highly pure SC cultures were then subjected to cell viability assays, yet no differences in the survival rate were determined between WT and SCCx43KO cell cultures on day 4 of culture. Additional measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) were performed, which indicate significant increases in TEER values of the SCCx43KO cells. Using semi-quantitative WB, the TJ protein claudin11 was found to be elevated in SCCx43KO cell cultures and significantly increased in testes homogenate of adult SCCx43KO mice. Thus a SC line deficient of Cx43 may provide a valuable in vitro tool for a better understanding of the mechanistic role of Cx43 in spermatogenesis and BTB assembly, and this model might aid in finding treatment schemes of male infertility due to impaired spermatogenesis. Thus, the use of SCCx43KO in ex vivo studies can provide supplementary information on the regulation of other TJ proteins of the BTB. On the other hand the development of SCCx43KO and WT immortalized cell lines (or primary cell cultures) can additionally provide further insights into the complex junctional communications between SC (with and without Cx43). The ultimate goal is to answer the question: what role Cx43 plays within the SC and which role might Cx43 play in impaired spermatogenesis. The SCCx43KO mouse model might be suitable to elucidate the cause of Cx43 downregulation in men with either impaired spermatogenesis or CIS. Finally, it could also be used to study Cx43 as a potential male contraceptive target for the reversible regulation of spermatogenesis.