Organ and cell tropism and molecular characteristics of Schmallenberg virus infection in ruminants and mouse models
The Schmallenbergvirus (SBV), a novel, insect-transmitted Orthobunyavirus of the Simbu serogroup, emerged in autumn 2011 in Northern Germany, the Netherlands and Belgium and rapidly spread across the domestic ruminant and wildlife population in Europe. In adult ruminants SBV infection passes predominantly subclinically or may be associated with a mild transient disease course. In pregnant cattle, sheep, and goats infection during a critical gestation period can lead to severe malformations in aborted, stillborn, or fullterm offspring also referred to as arthrogryposis-hydranencephaly syndrome. After the emergence of SBV, diagnosis was restricted to quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR), whereas a diagnostic tool enabling SBV genome detection on paraffin-embedded material to characterize SBV cellular tropism was not available. Furthermore, the characterization of SBV tropism in peripheral organs of malformed animals to further elucidate SBV-associated pathomechanisms and especially a potential persisting infection was lacking. In the framework of the current study, an SBV-specific in situ hybridization (ISH) probe and protocol was established and characterized SBV predominantly as a neurotropic virus. Using ISH SBV-RNA was detected in the brain of 17% of malformed, SBV-RTqPCR-positive tested small ruminants and 6% of the calves. In lambs and goat kids, the positive ISH signal and was constantly associated with non-suppurative inflammation, whereas similar lesions were absent in SBV-ISH positive tested calves. These findings suggested that the SBV infection may persist in the fetus after transplacental transmission and revealed an association of SBV-RNA and inflammation in immunocompetent animals. The subsequent characterization of the SBV organ tropism in malformed ruminants using SBV-specific immunohistochemistry (IHC) and ISH revealed an absence of viral antigens and RNA in peripheral organs and muscles. These observations confirmed that in utero transmission of SBV does not result in a persisting SBV infection in peripheral organs and suggested the SBV-associated muscular hypoplasia as a sequel of neuronal loss in the brain and spinal cord leading to denervation of the muscles. To further characterize SBV epidemiology and to address the question of a circulation of SBV in the German domestic and wildlife ruminant population before the epidemic spread in 2011, a retrospective study using brain samples archived between 1961 and 2010 was performed. IHC and ISH did not detect SBV-specific protein or RNA, respectively. These results substantiate the hypothesis that SBV has to be considered as a truly emerging pathogen that has been introduced into the European ruminant population from tropical or subtropical regions. To generate a platform to study SBV molecular characteristics, the present study additionally included a cooperative project with the University of Glasgow focusing on the development of in vitro and in vivo models to study SBV pathogenesis, tropism, and virus-host cell interactions. In cell culture synthetic SBV (sSBV) and wild type SBV (WT SBV) were characterized by a wide tropism and possessed similar replication kinetics. The virulence and neurotropism of both SBV types was confirmed in vivo after intracerebral inoculation of newborn mice. In the murine model brain lesions such as neuropil vacuolation and malacia were observed, which might be a preliminary stage for porencephaly and hydranencephaly as described in SBV-infected malformed ruminants. To further characterize molecular determinants of SBV virulence, SBV was sequentially passaged 32 times in cell culture. This classical approach to attenuate viruses surprisingly resulted in a SBV variant (SBVp32) displaying increased virulence in the murine model compared to WT SBV. Sequencing of SBVp32 revealed a variety of mutations, which might contribute to the increased pathogenicity by influencing SBV cell receptor affinity or modulate the host antiviral response, respectively. It was also demonstrated, that a SBV deletion mutant of the nonstructural NSs protein (SBVΔNSs) is less virulent in mice than wild type SBV. This attenuation is suggested to result from the inability of SBΔNSs to block interferon synthesis in virus infected cells. Therefore a subsequent in vitro and in vivo study was performed in cooperation with the University of Glasgow that focused on the SBV NSs as a virulence factor and its associated molecular mechanisms to modulate the antiviral host response. It was demonstrated, that the NSs protein of SBV mediates the degradation of the RPB1 subunit of the RNA polymerase II and consequently inhibits global cellular protein synthesis. Additionally, SBV NSs seems to enhance apoptosis indicating that this protein modulates different factors of SBV pathogenesis. Summarized, these studies presented provided substantial information about SBV pathogenesis and epidemiology in naturally-infected ruminants. Furthermore, the murine model was characterized as a valuable approach to examine the molecular determinants of SBV pathogenicity, as demonstrated for the SBV NSs, a non-essential protein for SBV viability, but an important virulence factor.
Das Schmallenberg-Virus (SBV) stellt ein neuartiges, durch Insekten übertragenes Orthobunyavirus der Simbu-Serogruppe dar. Dieses Virus wurde erstmals im Herbst 2011 in Norddeutschland, den Niederlanden sowie Belgien nachgewiesen und verbreitete sich innerhalb kurzer Zeit in der Haus- und Wildwiederkäuerpopulation Europas. In adulten Wiederkäuern verläuft die akute SBV-Infektion überwiegend subklinisch oder manifestiert sich als milde, transiente Erkrankung. Bei Kühen, Schafen oder Lämmern kann die SBV-Infektion in einem vulnerablen Stadium der Trächtigkeit mit dem Auftreten schwerer Missbildungen bei abortierten, tot geborenen oder ausgetragenen Nachkommen assoziiert sein. Diese Malformationen werden als Arthrogrypose-Hydranencephalie-Syndrom bezeichnet. Nach dem Ausbruch der SBV-Epidemie basierte der labordiagnostische Nachweis des SBV auf einer quantitativen Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkripiton (RT-qPCR). Eine Methode zur Visualisierung des SBV-Genoms, die eine Charakterisierung des SBV Zelltropismus an Paraffin-eingebetteten Gewebeproben ermöglicht, stand nicht zur Verfügung. Zudem war der Tropismus des SBV in peripheren Organen unbekannt, der im Hinblick auf die Fragestellung einer persistierenden Infektion einen relevanten Aspekt der SBV-Pathogenese darstellt. Im Rahmen der durchgeführten Studie wurde eine SBV-spezifische Sonde sowie ein entsprechendes Protokoll etabliert, das zur selektiven Detektion viraler RNS mittels in situ- Hybridisierung (ISH) verwendet werden kann und die Charakterisierung des SBV als primär neurotropes Virus ermöglichte. Mittels ISH wurde Gehirngewebe von SBV-RT-qPCR positiv getesteten kleinen Wiederkäuern und Kälbern mit angeborenen, SBV-typischen Missbildungen untersucht und virale RNS in 17% bzw. 6% der Gewebeproben nachgewiesen. Bei Lämmern und Ziegen war eine positive SBV-ISH Reaktion mit dem Auftreten einer Enzephalitis korreliert, während bei den SBV-ISH positiv getesteten Kälber keine entzündlichen Infiltrate vorlagen. Anhand dieser Ergebnisse wurde gezeigt, dass das SBV nach intrauteriner Übertragung im zentralen Nervensystem missgebildeter Wiederkäuer persistieren kann. Zudem wurde nachgewiesen, dass das Vorhandensein viraler RNS bei immunkompetenten Tieren mit dem Auftreten einer Entzündungsreaktion einhergeht. Im Rahmen einer weiteren Studie, mit dem Ziel, den Organtropismus des SBV mittels Immunhistochemie (IHC) und ISH zu charakterisieren, wurde kein Virus spezifisches Protein bzw. RNS in peripheren Organen und Muskulatur missgebildeter Wiederkäuer nachgewiesen. Aufgrund dessen ist davon auszugehen, dass eine intrauterine Übertragung des SBV nicht zu einer persistierenden Infektion in den peripheren Organen der infizierten Nachkommen führt. Zudem wurde gezeigt, dass die SBV-assoziierte Muskelhypoplasie wahrscheinlich sekundär aus dem Verlust von Neuronen im Gehirn und Rückenmark und konsekutiven Defizienten der muskulären Innervation resultiert. Im Hinblick auf die epidemiologisch relevante Fragestellung, ob das SBV möglicherweise schon vor 2011 in der deutschen Haus- und Wildwiederkäuerpopulation zirkulierte, erfolgte eine retrospektive Studie unter Verwendung von archiviertem Gehirngewebe aus den Jahren 1961 bis 2010. Mittels IHC und ISH wurden weder SBV spezifische Proteine, noch RNS in den untersuchten Proben nachgewiesen. Diese Ergebnisse entsprechen der Hypothese, dass das SBV in Europa einen neuartigen Erreger darstellt, der aus tropischen oder subtropischen Regionen stammt. Um weitere molekulare Eigenschaften des SBV zu untersuchen, wurden im Rahmen eines Kooperationsprojektes mit der Universität Glasgow in vitro und in vivo Modelle entwickelt und zur Charakterisierung des Tropismus, der Pathogenese sowie der Interaktion des SBV mit dem Wirtsorganismus verwendet. In der Gewebekultur zeigten sowohl das Wildtyp SBV (WT SBV) als auch ein synthetisches Virus (sSBV) einen breiten Zelltropismus und eine ähnliche Replikationskinetik. Zur Charakterisierung der Virulenz und des Neurotropismus beider SBV-Varianten in vivo wurden neugeborene Mäuse intrazerebral inokuliert. Die SBV Infektion war bei beiden Virusvarianten mit Vakuolisierung des Neuropils und Malazie assoziiert, die möglicherweise eine Vorstufe von Porenzephalie und Hydranenzephalie darstellen, die bei SBV infizierten Wiederkäuern mit Missbildungen auftreten. Um weitere Aussagen über Virulenzfaktoren des SBV treffen zu können, wurde das WT SBV sequentiell über 32 Zellpassagen kultiviert. Dieser klassische Ansatz um Viren zu attenuieren resultierte allerdings in einer SBV-Variante (SBVp32), die eine höhere Virulenz im Vergleich zum Wildtyp-Virus aufwies. Anhand der Sequenzierung des SBVp32 stellten sich verschiedene Mutationen dar, die möglicherweise zu einer Pathogenitätssteigerung aufgrund einer erhöhten Affinität des SBV zu den spezifischen Zielrezeptoren führen bzw. die antivirale Wirtsreaktion modulieren. Es wurde gezeigt, dass eine SBV Deletionsmutante des Nicht- Strukturproteins NSs im Mausmodell eine geringere Virulenz als das WT SBV besitzt. Diese Variante scheint, im Vergleich zum Wildtyp-Virus nicht das Potential zu besitzen, die Interferon-Antwort des Wirtsorganismus effektiv unterdrücken zu können. Aus diesem Grund wurde im Rahmen eines weiteren Kooperationsprojektes mit der Universität Glasgow das SBV NSs als potenzieller SBV-Virulenzfaktor untersucht, um dessen Einfluss auf die antivirale Wirtsantwort in vitro und in vivo auf molekularer Ebene zu charakterisieren. Es wurde gezeigt, dass das NSs Protein des SBV die Degradation der RPB1 Untereinheit der RNS Polymerase II bewirkt und auf diese Weise die zelluläre Proteinsynthese inhibiert. Zudem scheint das SBV NSs einen Apoptose induzierenden Virulenzfaktor darzustellen und folglich verschiedene Aspekte der Pathogenese des SBV Infektion zu modulieren. Anhand der durchgeführten Untersuchungen wurden substantielle Erkenntnisse über die Pathogenese und Epidemiologie des SBV in natürlich infizierten Wiederkäuern gewonnen. Zudem wurde das Mausmodell als geeignetes System beschrieben, das zur Charakterisierung weiterer Virulenz assoziierter Mechanismen des SBV verwendet werden kann. Dies erfolgte im Rahmen der durchgeführten Studie für das NSs, welches ein nicht-essentielles Protein für die Virus-Vitabilität darstellt, aber als wichtiger Virulenzfaktor fungiert.
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