Rekombinante Antigene als Vakzinekandidaten gegen den Rinderlungenwurm Dictyocaulus viviparus – in vitro Untersuchungen und Immunisierungsversuche

Der Rinderlungenwurm D. viviparus ruft schwere Infektionen in seinem Wirt hervor, die als parasitäre Bronchopneumonie oder Diktyokaulose des Rindes bekannt ist. Um die Tiere vor dieser Parasitose zu schützen und die erheblichen wirtschaftlichen Verluste zu minimieren, ist ein attenuierter Lebendimpfstoff in einigen europäischen Ländern verfügbar. Diese Vakzine hat jedoch eine Reihe von Nachteilen, weshalb die Entwicklung einer rekombinanten Subunit-Vakzine erstrebenswert wäre. Diese Arbeit verfolgte das Ziel der Entwicklung eines in vitro-Assays zur Evaluierung vielversprechender rekombinanter Vakzinekandidaten gegen D. viviparus. Solche Tests könnten dabei helfen, vielversprechende Impfkandidaten vor dem Einsatz im Tier auf ihre Immunogenität zu testen. Darüber hinaus wurde das Muskelprotein Paramyosin (PMY) rekombinant in E. coli und P. pastoris exprimiert (sog. EcPMY und PpPMY) und in drei klinischen Studien als rekombinanter Vakzinekandidat gegen den Rinderlungenwurm eingesetzt. Immunhistochemische Untersuchungen sollten überdies die Lokalisation von PMY im Körpergewebe von D. viviparus nachweisen. Im Zuge der in vitro-Assays wurden verschiedene Immunzellpopulationen (PMBC, DC, T- Zellen) mit rekombinanten Lungenwurmproteinen (EcPMY, PpPMY, CPL, CPB-1, CPB-2, CPB-3, LEG-1, LEG-2, MSP, NMT und PDI) stimuliert, um deren potentielle Eignung als Impfkandidaten zu analysieren. Die rekombinanten Proteine CPB-2, CPB-3, CPB’s, NMT, LEG-1 und LEG-2 konnten die PBMC-Proliferation nach in vitro Stimulation signifikant beeinflussen. Darüber hinaus resultierte die DC Stimulation und anschließende Co- Kultivierung mit autologen T-Zellen in einer signifikant erhöhten T-Zellproliferation im Falle von MSP, NMT, PpPMY, CPB-1, CPB-2, CPB-3, LEG-1 und LEG-2. Nach PpPMY- Stimulation der DC zur Analyse der Expression von Zelloberflächen-Rezeptoren konnte eine signifikant erhöhte CD86-Expression beobachtet werden. Trotz dieser vielversprechenden Ergebnisse der Immunzell-Assays ist die Aussagekraft der durchgeführten Assays fraglich, da die ausgewählten Positivkontrollen Ovalbumin (OVA) bzw. E. coli-Lysat keine statistisch signifikante Stimulation der Zellen jedes Tieres induzieren konnten. Die durchgeführten klinischen Vakzineversuche basierten auf dem Lungenwurm-Muskelprotein Paramyosin, welches in den immunhistochemischen Versuchen in der Muskulatur der Körperwand sowie in der Pharynxmuskulatur des Lungenwurmes nachgewiesen werden konnte. Das rekombinant exprimierte PMY wurde entweder mit dem Adjuvans Matrix-QTM oder Quil A in drei Vakzineversuchen in Rindern getestet. EcPMY+Matrix-QTM induzierte dabei unter Berücksichtigung des geometrischen Mittelwertes eine Reduktion der Wurmbürde von 36,11 %, PpPMY+Matrix-QTM von 20,66 % und PpPMY+Quil A von 18,37 %. Die Larvenausscheidung nach Vakzinierung mit PpPMY+Matrix-QTM sowie mit PpPMY+Quil A war um 43,65 % bzw. 22,60 % reduziert. Dahingegen resultierte die Vakzinierung mit EcPMY+Matrix-QTM in einer um 5,05 % erhöhten Larvenausscheidung. Statistisch signifikant kürzere weibliche Lungenwürmer (p=0,042) wurden infolge der EcPMY+Matrix-QTM-Impfung dokumentiert, sowie signifikant kürzere weibliche (beide Versuche p<0,001) als auch männliche (p=0,023; p<0,001) Würmer durch Impfung mit PpPMY+Matrix-QTM sowie PpPMY+Quil A. Die Antikörperentwicklungen nach ELISA-Untersuchungen zeigten bei den geimpften Rindern einen Anstieg der Antikörperklassen, insbesondere von IgG und IgG1 und zusätzlich von IgA durch PpPMY+Matrix-QTM und PpPMY+Quil A. Die Kontrolltiere hingegen zeigten keinen Anstieg von Antikörperklassen, die mit Ereignissen der klinischen Versuche in Zusammenhang gebracht werden könnten. Die PBMC-Assays an verschiedenen Zeitpunkten während der Vakzineversuche resultierten nach in vitro Stimulation mit rPMY in erhöhten Proliferationen nach der dritten Vakzinierung, nicht aber nach der Belastungsinfektion. Dies galt jedoch nicht für den Vakzineversuch mit PpPMY+Quil A, da hier zu keinem Zeitpunkt eine Proliferation detektiert werden konnte. Diese fehlende in vitro PBMC-Stimulation ist vermutlich auf das gewählte Adjuvans zurückzuführen. Der ausgebliebene „Boostereffekt“ auf die PBMC als auch die Antikörpertiter nach der Belastungsinfektion legt die Vermutung nahe, dass natives Lungenwurm-PMY ein sogenanntes hidden antigen darstellt. Zukünftig könnte rekombinantes PMY in Kombination mit anderen rekombinanten Lungenwurmproteinen getestet werden, um möglicherweise eine synergistische Wirkung zu erreichen.