Einfluss boviner Trophoblastprodukte auf die Synthese und den Umbau der Extrazellulären Matrix (EZM) durch plazentare Fibroblasten in vitro

Der Umbau der endometrialen und plazentaren EZM ist ein entscheidender Prozess für einen physiologischen Ablauf der Trächtigkeit beim Rind. Es ist noch nicht bekannt, welche Regulationsmechanismen dieser Remodellierung der EZM zu Grunde liegen. Als regulatorische Zellen kommen die Trophoblastriesenzellen (TGC) in Frage, weil ihre Produkte durch Hybridzellen in das endometriale, plazentare Stroma exozytiert werden. Diese Produkte wiederum könnten parakrine Wirkungen auf die stromalen Fibroblasten haben. Fibroblasten besitzen die Fähigkeit zur Synthese von Matrixmolekülen und Matrixmetalloproteinasen (MMP), welche für den Umbau der EZM hauptverantwortlich sind. Daher wurde in dieser Arbeit der Einfluss der TGC-Produkte auf die Synthese und den Umbau der EZM durch bovine, plazentare Fibroblasten untersucht. Für die Versuche wurden aus Rinderplazentomen isolierte Fibroblastenzelllinien in einem Zellkulturmodell mit unterschiedlichen trophoblastären Faktoren stimuliert und die Expression von MMP, Tissue Inhibitors of Matrix-Metalloproteinases (TIMP) und verschiedenen EZM-Komponenten analysiert. Als Stimulanzien wurden Epidermal Growth Factor (EGF), Insulin-like Growth Factor (IGF1) -1, -2, Fibroblasten-wachstumsfaktoren (FGF) -1, -2, -4, -7, EGF + IGF1, EGF + IGF2, bovines plazentares Laktogen (bPL) und kotyledonen-konditioniertes Medium (KKM) verwendet. Anschließend erfolgte mittels RT-PCR eine Erfassung des mRNA-Expressionsprofils von MMP1, -2, -8, -9, -14, TIMP1, -2 sowie von Kollagen I, -IV, Laminin B, Laminin C und Fibronektin. Stimulanzien, die vielversprechende Expressionsveränderungen der untersuchten Gene auf mRNA-Ebene hervorriefen, wurden mittels quantitativer Real-time PCR näher analysiert. Weiterhin wurden auf mRNA-Ebene beeinflusste Gene mittels Western Blot und Zymographie auf Proteinebene weitergehend untersucht. Abschließend wurden mittels MTT-Assay (Zellproliferation) und Live-Cell Imaging (Zellmotilität) biologische Wirkungen der Stimulanzien auf die kultivierten Fibroblasten ermittelt. Die Untersuchungen der Genexpression zeigten eine erhöhte mRNA-Expression von MMP1 durch FGF2 (1,14fach) und KKM (1,23fach). Im Gegensatz dazu verringerte die Stimulation mit FGF7 (0,9fach) und bPL (0,91fach) die MMP1-Expression. Auf Proteinebene (Western Blot) zeigten diese Faktoren die gleiche Tendenz die Expression von MMP1 zu beeinflussen, jedoch nicht auf signifikantem Niveau. Mittels Zymographie konnte keine erhöhte proteolytische MMP1-Aktivität dargestellt werden. MMP14 wurde auf mRNA-Ebene durch FGF2 (0,81fach), FGF4 (0,87fach) und KKM (0,87fach) in der Expression signifikant herunter reguliert, wobei sich diese Veränderungen nicht auf Proteinebene darstellen ließen. TIMP2-mRNA wurde durch KKM (2,75fach) deutlich hochreguliert, wohingegen TIMP2 auf Proteinebene nicht detektiert werden konnte. Das Expressionsprofil von MMP9 wurde nur geringfügig auf mRNA-Ebene beeinflusst, während MMP2 und TIMP1 in ihrer Expression unverändert blieben. MMP8 konnte nicht in ausreichender Menge detektiert werden. Die Expression von Laminin mRNA verringerte sich durch Behandlung mit FGF4 (0,88fach), FGF7 (0,87fach) und bPL (0,81fach) signifikant, ohne dass diese Veränderung auf Proteinebene sichtbar gemacht werden konnte. FGF2 (1,42fach) und KKM (1,23fach) induzierten eine erhöhte Expression von Kollagen I mRNA, wohingegen Kollagen IV durch FGF7 (0,77fach) und bPL (0,81fach) verringert wurde. Fibronektin zeigte keine Regulation durch die TGC-Produkte. Die Fibroblastenmotilität ließ sich durch FGF2 (1,15fach), EGF+IGF1 (1,55fach) und KKM (1,32fach) steigern, wobei FGF7 (0,92fach) wiederum einen hemmenden Einfluss hatte. Weiterhin wurde die Zellproliferation der Fibroblasten durch IGF1 (1,19fach) und IGF2 (1,16fach) angeregt, während die Inkubation mit bPL (0,74fach) zu einer Verminderung der Zellvermehrung führte. In der vorgelegten Arbeit konnten parakrine Wirkungen bestimmter TGC-Faktoren auf die Expression der MMP/TIMP und der EZM-Moleküle in plazentaren Fibroblasten aufgedeckt werden, die zu folgender Arbeitshypothese führten: Der invadierende Trophoblast induziert über seine Produkte eine gesteigerte (FGF2, KKM) oder eine abgeschwächte (FGF7, bPL) Expression von matrixdegradierenden Enzymen sowie Matrixmolekülen. Dieses suggeriert eine von TGC-Produkten regulierte (orchestrierte) Balance zwischen Gewebeaufbau und Gewebeabbau über die bovine, endometriale EZM, welche möglicherweise für das Remodelling während der Implantation und der weiteren EZM-Umbauprozesse während der Trächtigkeit verantwortlich ist. Die Analysen des KKM lassen vermuten, dass in vivo eventuell kumulative Effekte mehrerer Faktoren eine deutlichere Regulation auf mRNA- und Proteinebene bewirken. Weiterführend können die Ergebnisse dieser Arbeit helfen, physiologische Prozesse wie die Trophoblastinvasion, die Ablösung der Nachgeburt oder die postpartale Regression besser zu verstehen.