The effect of bacterial co-infection on the infection of well-differentiated porcine respiratory epithelial cells by swine influenza viruses
Swine influenza virus (SIV) and Streptococcus (S.) suis are common pathogens of the respiratory tract in pigs, both being associated with pneumonia. However, the interactions of these two pathogens with well-differentiated respiratory epithelial cells and the contribution to the pathogenesis of co-infection are only poorly understood. Here my colleagues and I established two primary cell culture systems for well-differentiated airway epithelial cells, porcine precision-cut lung slices (PCLS) and porcine airway air-liquid interface (ALI) cultures, to analyze the infection of SIV and/or S. suis. First I analyzed the viral or bacterial mono-infection of PCLS, on the one hand by five swine influenza A viruses of different subtypes and on the other hand by the parental S. suis serotype 2 as well as by different mutant streptococci, respectively. Infection of PCLS by SIV revealed that a higher ciliostatic effect and virus titer was obtained in PCLS infected by the H3N2 subtype viruses in comparison to the H1N1/2006 strain; these virulence properties of the different viruses correspond to the pathogenicity properties determined in animal experiments. Concerning the infection of S. suis, both the parental strain of S. suis and the mutants analyzed were able to adhere to and to efficiently colonize ciliated cells and the mucus-producing cells of the bronchiolar epithelium. These data indicate that PCLS provide a model that is able to assess the virulence of influenza A viruses and to study S. suis adherence and colonization. Bacterial co-infection often aggravates the clinical outcome both in humans and animals which is associated with a high risk of developing more complicated diseases. Hence, I further established the PCLS co-infection model for analyzing the effect of secondary S. suis infection after prior infection by SIV to address the interaction between both pathogens and their contribution to co-infection. I found that SIV promoted adherence, colonization, and invasion of S. suis in a two-step process. First, in the initial stages, the α-2,6-linked sialic acid present in the capsular polysaccharide of S. suis mediated the adherence of encapsulated, but not nonencapsulated, S. suis to SIV-infected cells, as a result of the direct interaction of the hemagglutinin of SIV with the α-2,6-linked sialic acid of S. suis. Second, at a later stage of infection, high-virulent SIV promoted S. suis adherence and invasion into deeper tissues by damaging ciliated epithelial cells. On the other hand, secondary bacterial infection had a negative effect on the replication of SIV. My finding revealed that at least two different mechanisms contribute to the beneficial effects of SIV on S. suis infection, including sialic acid-mediated bacterial attachment to SIV-infected cells and virus-mediated damage of ciliated epithelial cells. Primary airway epithelial cells maintained under ALI conditions allow the analysis of a wide variety of respiratory pathogens but few studies has been reported about bacterial infection on ALI so far. My colleague and I established porcine airway ALI cultures, for porcine tracheal epithelial cells (PTEC) as well as for porcine bronchial epithelial cells (PBEC), to analyze the contribution of suilysin, a bacterial cytolysin, to the virulence properties of S. suis infection. I found that the suilysin-positive S. suis serotype 2 wt showed not only higher adherence but also a substantially higher number of intracellular bacteria in both PTEC and PBEC as compared to a suilysin-deficient mutant (10Δsly). In addition, a decreased amount of ciliated cells was observed as a result of localized lesions. Furthermore, increased apoptosis was detected on PBEC infected with suilysin-positive wt streptococci. My findings suggest that the soluble suilysin plays a crucial role in mediating invasion of S. suis into well-differentiated porcine respiratory epithelial cells and that most likely suilysin-dependent apoptosis is responsible for respiratory epithelial cell death.
Schweine-Influenzaviren (SIV) und Streptococcus (S.) suis sind verbreitete Krankheitserreger im Respirationstrakt von Schweinen, die beide zu Pneumonien führen können. Die Interaktionen dieser beiden Pathogene mit differenzierten respiratorischen Epithelzellen und ihr Beitrag zur Pathogenese der Co-Infektion sind noch wenig untersucht worden. Wir haben zwei primäre Zellkultursysteme für differenzierte Atemwegsepithelzellen etabliert, porzine Präzisionslungenschnitte (PCLS) und porzine respiratorische Air-Liquid-Interface (ALI)-Kulturen, um die Infektion durch SIV und/oder S. suis zu analysieren. Zunächst untersuchten wir die virale bzw. bakterielle Mono-Infektion, einerseits durch fünf Schweine-Influenza-A-Viren verschiedener Subtypen, andererseits durch den parentalen S. suis-Serotyp 2 sowie durch verschiedene Streptococcus-Mutanten. Infektionen von PCLS durch SIV zeigten, dass Virus vom Subtyp H3N2 zu einem größeren ziliostatischen Effekt und zu einem höheren Virustiter führte als ein H1N1/2006-Stamm; diese Virulenzeigenschaften der verschiedenen Viren entsprechen den Pathogenitätseigenschaften, die in Tierversuchen bestimmt worden sind. Hinsichtlich der S. suis-Infektion waren sowohl der parentale Stamm als auch die analysierten Mutanten in der Lage, an zilientragende und mukus-produzierende Zellen des Bronchilarepitheliums zu adhärieren und sie zu kolonisieren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass PCLS ein Modellsystem darstellen, mit dem sich die Virulenz von Influenza-A-Viren bestimmen lässt und mit dem man die Adhärenz, Kolonisation und Invasion von S. suis untersuchen kann. Bakterielle Co-Infektionen erschweren oft das klinische Bild bei Mensch und Tier und sind mit einem erhöhten Risiko assoziiert, kompliziertere Krankheiten zu entwickeln. Daher etablierten wir PCLS als Co-Infektionsmodell, um die Wirkung einer sekundären S. suis-Infektion nach einer vorausgegangenen SIV-Infektion zu analysieren und die Interaktion zwischen beiden Pathogenen und ihren Beitrag zur Co-Infektion zu untersuchen. Wir fanden, dass SIV die Adhärenz, Kolonisation und Invasion von S. suis in einem Zwei-Stufen-Prozess förderte. Erstens war die α-2,6-verknüpfte Sialinsäure des Kapselpolysaccharids von S. suis im Initialstadium dafür verantwortlich, dass bekapseltes, aber nicht unbekapseltes S. suis, an SIV-infizierte Zellen adhärieren konnte, und zwar als Ergebnis einer direkten Interaktion zwischen dem Hämagglutinin von SIV und der α-2,6-gebundenen Sialinsäure von S. suis. Zweitens förderte hoch-virulentes SIV im Spätstadium der Infektion die bakterielle Adhärenz an und Invasion von tiefer liegendem Gewebe, indem die zilientragenden Epithelzellen geschädigt wurden. Im Gegensatz dazu hatte die sekundäre Bakterieninfektion einen negativen Effekt auf die Replikation von SIV. Unsere Arbeit zeigte, dass mindestens zwei verschiedene Mechanismen zur förderlichen Wirkung von SIV auf die S. suis-Infektion beitragen, nämlich die sialinsäure-vermittelte bakterielle Bindung an SIV-infizierte Zellen und die virus-vermittelte Schädigung der zilientragenden Epithelzellen. Primäre Atemwegsepithelzellen, die unter Air-Liquid-Interface (ALI)-Bedingungen gehalten werden, ermöglichen die Analyse einer großen Vielfalt respiratorischer Pathogene, aber bislang liegen nur wenige Untersuchungen über bakterielle Infektionen von ALI-Kulturen vor. Wir etablierten porzine respiratorische ALI-Kulturen, und zwar porzine Trachealepithelzellen (PTEC) und porzine Bronchialepithelzellen (PBEC), um den Beitrag von Suilysin, eines bakteriellen Cytolysins, zu den Virulenzeigenschaften der S. suis-Infektion zu analysieren. Wir fanden, dass im Vergleich zu einer suilysin-defizienten Mutante (10Δsly) der suilysin-positive S. suis-Serotyp 2 (Wildtyp) nicht nur eine höhere Adhärenz, sondern auch eine deutlich erhöhte Zahl intrazellulärer Bakterien, in PTEC ebenso wie in PBE, aufwies. Zusätzlich wurde eine verringerte Zahl zilientragender Zellen beobachtet, als Ergebnis lokaliserter Läsionen. Weiterhin wurde in PBEC, die mit suilysin-positiven Streptokokken infiziert waren, eine erhöhte Apoptosis festgestellt. Unsere Ergebnisse sprechen dafür, dass lösliches Suilysin eine entscheidende Rolle spielt bei der Vermittlung einer S. suis-Invasion von differenzierten porzinen respiratorischen Epithelzellen und dass suilysin-abhängige Apoptosis verantwortlich ist für den Tod respiratorischer Epithelzellen.
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