Identification, dynamic regulation and putative functions of polysialylated proteins in oligodendrocyte precursors and microglia

Polysialinsäure (PolySia) ist ein entscheidender Modulator der Migration und Differenzierung von Vorläuferzellen und dementsprechend eng mit der neuralen Entwicklung und Plastizität verknüpft. Der Hauptträger von PolySia im Vertebratengehirn ist das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM. Die Synthese von PolySia wird durch die beiden Polysialyltransferasen (PolySTs) ST8SIA2 und ST8SIA4 katalysiert. Aufgrund der ausgeprägten Akzeptorspezifität beider Enzyme wurden bislang nur wenige weitere polysialylierte Trägermoleküle identifiziert. Eines davon, das synaptische Zelladhäsionsmolekül SynCAM 1, wurde im perinatalen Mausgehirn beschrieben. Die Funktionen, die zelluläre Verteilung und die subzelluläre Lokalisation von PolySia-SynCAM 1, sowie dessen Existenz im Menschen blieben bislang jedoch ungeklärt. In der ersten Studie der vorliegenden Doktorarbeit konnte unter Verwendung muriner Gliakulturen gezeigt werden, dass PolySia-SynCAM 1 eine Subpopulation von NCAM-negativen Zellen innerhalb der heterogenen Gruppe der NG2 exprimierenden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) definiert. In diesen Zellen ist PolySia ausschließlich an N-Glykane geknüpft. Die Analyse von Primärkulturen aus Mäusen, denen NCAM und jeweils eine der beiden PolySTs fehlte, zeigte, dass PolySia auf SynCAM 1 ausschließlich von ST8SIA2 synthetisiert wird. Für die zweite Studie der Doktorarbeit wurden humane embryonale Stammzellen gezielt zu OPCs differenziert. Diese OPC-Kulturen ermöglichten es, SynCAM 1 als neues Trägerprotein für PolySia im Menschen zu identifizieren. Zudem zeigte die Studie, dass - im Gegensatz zu murinen OPCs - alle humanen OPCs PolySia auf den NCAM-Isoformen 140 und 180 co-exprimierten. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass während der abschließenden Differenzierung von OPCs zu MBP-positiven Oligodendrozyten PolySia auf beiden Trägermolekülen herabreguliert wird. In der ersten Studie konnte zudem in allen Ncam-/- Mikroglia durch ST8SIA4 synthetisierte PolySia auf O-Glykanen nachgewiesen werden. Dies deutete auf die Existenz eines weiteren PolySia-Trägers in diesen Zellen hin. Tatsächlich handelte es sich bei diesem PolySia-Trägermolekül um Neuropilin-2 (NRP2). Polysialyliertes NRP2 wurde zuvor ausschließlich auf der Zelloberfläche von dendritschen Zellen und exudaten Makrophagen beschrieben. Vor kurzem wurde die Differenzierung von Mikroglia aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSdM) etabliert. Die Verwendung dieser Zellen ermöglichte es, in der dritten Studie der vorliegenden Doktorarbeit die Polysialylierung von Mikroglia weitergehend zu untersuchen. Im Gegensatz zu primären murinen Mikroglia, welche aus dem Gehirn abgeleitet wurden, waren alle iPSdM NCAM-negativ. Es konnte gezeigt werden, dass diese Zellen PolySia auf NRP2, sowie auf E‑Selektin Ligand-1 (ESL-1) präsentieren. ESL-1 wurde in der aktuellen Studie als neuer, zuvor unbekannter Träger für PolySia identifiziert. Die Kombination der drei Studien dieser Doktorarbeit zeigt, dass alle polysialylierten Proteine in NCAM-negativen OPCs, murinen Mikroglia aus NCAM knockout-Mäusen und iPSdM strikt innerhalb des Golgi‑Apparates zurückgehalten werden. Bemerkenswerterweise konnte die PolySia in allen drei Zelltypen dynamisch umgeordnet werden. In OPCs erfolgte dies als Antwort auf Depolarisation, während eine Umorganisation von PolySia in Mikroglia als Antwort auf LPS-induzierte pro-inflammatorische Aktivierung zu beobachten war. In allen Zellen erfolgte zunächst eine rasche Translokation von PolySia aus dem Golgi auf die Zelloberfläche, worauf sich eine vollständige Depletion von PolySia anschloss. Eine mögliche Rolle dieser dynamischen PolySia Translokation in OPCs während der beginnenden Myelinisierung wird in der vorliegenden Arbeit diskutiert. Im Falle der iPSdM konnte nach LPS-Induktion polysialyliertes NRP2 und ESL-1 im Zellkulturmedium nachgewiesen werden. Vermittelt wurde diese Ausschüttung vermutlich durch ectodomain shedding, da eine Inhibition von Metalloproteinasen teilweise verhinderte, dass polysialylierte Proteine in das Zellkulturüberstand ausgeschüttet wurden. Schlussendlich konnte gezeigt werden, dass lösliche PolySia im Zellkulturmedium die Stickstoffmonoxid-Produktion von LPS-aktivierten primären murinen Mikroglia und iPSdM verringerte. Diese Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass ausgeschüttetes polysialyliertes NRP2 und ESL-1 eine Rolle in einem negativen Rückkopplungsmechanismus im Zuge der LPS-induzierten pro-inflammatorischen Aktivierung der Mikroglia spielen.