Occurrence of Clostridium botulinum neurotoxin genes and toxin-genotypes of Clostridium perfringens in dairy cattle

Fohler, Svenja

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Occurrence of Clostridium botulinum neurotoxin genes and toxin-genotypes of Clostridium perfringens in dairy cattle

German
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Ende der 1990er Jahre wurde ein neues Krankheitsbild in Milchviehherden beschrieben. Viele der Tiere auf den betroffenen Betrieben zeigten Anzeichen einer chronischen, fortschreitenden Erkrankung. Das beschriebene klinische Bild schloss vielfältige Symptome ein. Zu diesen gehörten sowohl Anzeichen einer Allgemeinerkrankung als auch Beeinträchtigungen des Bewegungsapparates und Symptome intestinaler Erkrankungen. Außerdem wurden Abmagerung und ein Rückgang der Milchleistung beobachtet. Nach eingehenden Untersuchungen war die einzige Gemeinsamkeit auf allen Betrieben der Nachweis von C. botulinum oder entsprechenden Toxinen. Die von dieser Gruppe von Bakterien in der Umwelt (ex vivo) produzierten Neurotoxine (BoNT) verursachen im klassischen Fall des „futtermittelassoziierten Botulismus“ eine akute Erkrankung, die durch die Blockade der Acetylcholinfreisetzung an der motorischen Endplatte zu Lähmungserscheinungen führt. Der Tod betroffener Individuen tritt schließlich durch Versagen der Atmung ein. Für den sogenannten „viszeralen Botulismus“ wurde eine andere Pathogenese postuliert. Die Bakterien selbst sollten aufgenommen werden, den Darm besiedeln und durch eine andauernde Produktion sublethaler Mengen Neurotoxins (in vivo) zu einer generalisierten chronischen Erkrankung führen. Um einen möglichen Kausalzusammenhang zwischen dem Vorkommen von C. botulinum und dem beschriebenen chronischen Krankheitsbild zu prüfen, wurde eine Fall-Kontroll-Studie durchgeführt. Es wurden auf 139 Milchviehbetrieben Faeces und Pansensaft von 1389 Tieren sowie Futtermittel- (n = 411) und Wasserproben (n = 139) genommen. Diese wurden nach Anreicherung in RCM (Reinforced Clostridial Medium) bei 37°C auf das Vorhandensein der Neurotoxingene (bont) A – F untersucht. Ergänzend wurden im Friedrich Loeffler-Institut (Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen, Jena) alle Kotproben bei 30°C in MCM (Modified Cooked Meat Medium) angereichert und ebenso auf des Vorhandensein von bont A – F getestet. Zusätzlich wurde dort eine direkte DNA Isolierung aus Kotproben getestet. In Probenmaterial von 25 (17,99%), 3 (2,16%), 0 (0,0%), 2 (1,44%), 1 (0,72%), und 3 (2,16%) Betrieben wurden Neurotoxingene der Typen A, B, C, D, E und F nachgewiesen. In elf Futtermittelproben wurde bont A nachgewiesen. Alle Wasserproben waren negativ. C. botulinum wurde ohne signifikante Unterschiede sowohl in Kot als auch in Pansensaftproben von chronisch kranken und klinisch gesunden Tieren von Kontroll- und Fall-Betrieben nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass vermehrungsfähige C. botulinum im Intestinaltrakt von klinisch gesunden Kühen vorkommen können. Die Ergebnisse dieser Studie können daher einen möglichen Kausalzusammenhang zwischen dem Vorkommen von C. botulinum und dem beschriebenen chronischen Krankheitsbild nicht bestätigen. In einem zweiten Projektteil wurden 662 Isolate von C. perfringens aus Probenmaterial derselben Tiere kultiviert. Dieser Keim ist ursächlich für verschiedene Krankheitsbilder, einschließlich histotoxischer und intestinaler Erkrankungen, bei Menschen und Tieren. Auch die verschiedenen mit C. perfringens assoziierten Erkrankungen werden durch die Wirkung von Toxinen verursacht. Um einen Einblick in die in deutschen Milchviehherden vorkommenden Toxintypen zu bekommen, wurden alle Isolate anhand ihrer Toxingene weiter molekularbiologisch Typisiert. Die meisten Isolate gehörten zum C. perfringens Typ A (n = 660). Des Weiteren wurden zwei dem Typ D zugeordnet. Von allen Isolaten von Faeces wurde bei insgesamt 64 (14.5%) die „consensus“ Variante und bei 138 (31.2%) die „atypische“ Variante des cpb-2 Gens nachgewiesen. Ebenso wurden beide Varianten bei 30 (14.5%) bzw. 54 (26.1%) der von Pansensaft kultivierten Isolate gefunden. Fünf (0.8%) aller Isolate waren positiv für das Enterotoxin-Gen. Dies bestätigt, dass Milchkühe keine primäre Quelle für potentiell humanpathogene Enterotoxingen positive C. perfringens darstellen. Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen die allgemeine wissenschaftliche Ansicht, dass beide Clostridium Spezies ubiquitär vorkommen und entweder gelegentlich (C. botulinum) oder häufig (C. perfringens) im Magen-Darm-Trakt von Milchkühen gefunden werden können.

In the end of the 1990s a new syndrome affecting dairy cattle was proposed. On supposedly affected farms, many animals suffered from a chronic lingering illness. The described clinical picture comprised a wide variety of symptoms. These included signs of a generalized disease, as well as effects on the locomotor or nervous system, and intestinal disorders. Additionally, emaciation and a loss in milk yield should be characteristic. Detection of C. botulinum or its toxins was the only consistent finding on affected farms, thus the disease was named “visceral botulism”. This group of bacteria is able to cause an acute disease due to the production of highly neurotoxic proteins (BoNTs). After their formation in the environment (ex vivo) these are classically taken up with food or feed. BoNTs are then resorbed into the blood stream, inhibit the release of acetylcholine at the neuromuscular junction and lead to an, in most cases, acute flaccid paralysis. Death often occurs due to respiratory failure. In contrast, for the “visceral botulism” another pathogenesis was assumed. After ingestion of cells or spores, a colonization of the intestine with subsequent production of low amounts of neurotoxins within the intestine (in vivo) was postulated. These should then cause a generalized chronic disease. To evaluate the possible causative role of C. botulinum in the proposed syndrome, a case-control study was carried out. Feces and rumen content of 1389 animals from 139 farms as well as feed (n = 411) and water samples (n = 139) were collected. All samples were tested by real time-PCR for the presence of C. botulinum types A to F after enrichment at 37°C in RCM (Reinforced Clostridial Medium). The fecal samples were also enriched at the Friedrich Loeffler-Institut (Institute of Bacterial Infections and Zoonoses, Jena, Germany) in MCM (Modified Cooked Meat Medium) at 30°C and tested with a conventional PCR. In addition, an attempt was made to directly isolate DNA from fecal samples without the inclusion of an enrichment step. In animal samples from 25 (17.99%), 3 (2.16%), 0 (0.0%), 2 (1.44%), 1 (0.72%), and 3 (2.16%) farms BoNT A, B, C, D, E, and F genes were detected, respectively. Eleven of all feed samples were BoNT A gene positive. C. botulinum was detected without significant differences in feces and rumen content from chronically diseased and clinically healthy animals from case as well as control farms. Moreover, it was shown that viable bacteria were present in the animals’ intestines without causing disease. Thus, a role of C. botulinum in the so called “visceral botulism” could not be confirmed. In a second study part, 662 isolates of C. perfringens were cultivated from rumen content, feces and feed. This pathogen is the causative agent of several diseases in animals and humans, including histotoxic infections and enteric diseases. Also the pathogenicity of C. perfringens is attributed to the production of different toxins. To gain more insight in the occurring types on dairy farms a further toxin genotyping was carried out. Additionally to the mainly detected type A (n = 660), two type D isolates were cultured. The consensus and atypical variants of the cpb2 gene were present in 64 (14.5%) and 138 (31.2%) of all isolates from feces, and 30 (14.5%) and 54 (26.1%) of all isolates from rumen content, respectively. Thus, both allele variants of the cpb2 gene were frequently present in the cultured isolates, whereby the atypical variant dominated. Only 5 (0.8%) of all isolates were positive for the enterotoxin gene. This confirms that dairy cattle seem to be no primary source for potentially human pathogenic enterotoxin gene positive C. perfringens. The outcome of the studies presented here support the general opinion that both bacteria are ubiquitous and can be either occasionally (C. botulinum) or frequently (C. perfringens) found in the intestine of dairy cows.