Analysis of viral and host factors influencing Alphacoronavirus life cycle in chiropteran and porcine cell lines

Coronaviren (CoV) sind behüllte, einzelsträngige RNA Viren mit positiver Orientierung. Sie besitzen drei bis vier Hüllproteine, das Spike-Protein (S), Membran-Protein (M), Envelope-Protein (E) und einige Vertreter der Betacoronaviren weisen das Hämagglutinin-Esterase-Protein auf. Innerhalb des Viruspartikels befindet sich das Nukleokapsid-Protein, welches mit der RNA assoziiert ist. CoV infizieren Säugetiere, einschließlich des Menschen, sowie Vögel. Es ist bekannt, dass Coronaviren vom Tier auf den Menschen, wie auch zwischen verschiedenen Tierarten übertragen werden können. Seit dem Ausbruch des schweren akuten Atemwegssyndroms (SARS), ausgelöst durch SARS-CoV, stehen insbesondere Fledermäuse im Fokus der Forschung, da sie als Reservoir für SARS-CoV, wie auch für weitere CoV gesehen werden. Das Virus der übertragbaren Gastroenteritis (TGEV), ein Vertreter der Alphacoronaviren, diente in dieser Studie als Modell-Coronavirus. Der Eintritt, die Replikation, sowie das Freisetzen von TGEV wurden in verschiedenen Fledertier-Zelllinien untersucht. Die Oberflächenexpression des spezies-spezifischen Rezeptors, der porzinen Aminopeptidase N, war dabei notwendig um den Eintritt von TGEV in Fledertierzellen zu ermöglichen. Abhängig von der getesteten Fledertierspezies wurden unterschiedliche Rezeptor-Expressionslevel, sowie  Virustiter gemessen. Des Weiteren wurden verschiedene Expressionsmuster für das TGEV S- und M-Protein beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des spezifischen Rezeptors eine wichtige Voraussetzung für den viralen Eintritt darstellt. Die kalkulierten Virustiter aus den Zellkulturüberständen deuten darauf hin, dass weitere Faktoren die Replikation innerhalb der Fledertierzellen beeinflussen. Betrachtet man die unterschiedlichen Verteilungen der TGEV S- und M-Proteine während der Infektion, scheinen Wirtsfaktoren, sowohl abhängig von der Fledermausart als auch vom betroffenen Organ, eine wichtige Rolle für eine erfolgreiche Coronavirusinfektion zu spielen. Aus diesem Grund wurden zelluläre Faktoren, welche mit dem CoV S-Protein interagieren, näher untersucht. Das S-Protein vermittelt das Anheften an den Wirtszellrezeptor, sowie den Viruseintritt. Für einige Viren konnte bereits gezeigt werden, dass Mikrotubuli für den Transport viraler Komponenten innerhalb der Wirtszelle genutzt werden. In dieser Studie konnte demonstriert werden, dass die letzten 39 Aminosäuren der zytoplasmatischen Domäne des S-Proteins von TGEV und den humanen CoV 229E und NL63 mit Tubulin-alpha- und -beta-Ketten interagieren. Zudem co-lokalisierte das TGEV S-Protein mit β-Tubulinen der Wirtszelle. Eine  induzierte Depolymerisierung der Mikrotubuli führte zu einer Änderung in der TGEV S-Protein Verteilung in infizierten Zellen. Hierbei co-lokalisierten TGEV S-Proteine mit dem ER-Golgi intermediären Kompartment (ERGIC) und mit dem Golgi-Apparat, wobei diese Kompartimente, nach Nocodazole-Behandlung (NOC) verstreut in der Zelle vorlagen. Zusätzlich wurden ein reduzierter Austritt von infektiösen Viruspartikeln und ein verminderter Einbau der S-Proteine in die Virushülle detektiert. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass eine Interaktion des CoV S-Proteins mit zellulärem Tubulin den Zusammenbau und die Freisetzung von Viruspartikeln begünstigt.  Neben der Virus-Wirts-Interaktion beeinflusst auch das Zusammenspiel der viralen Proteine den Vermehrungszyklus von CoV. Deren Replikation findet im Zytosol der Wirtszelle statt, wobei der Zusammenbau und die Knospung der Viruspartikel am ERGIC erfolgen. Protein-Protein, sowie Protein-RNA Interaktionen sind in diesen Schritten von großer Bedeutung. Das virale S-, M und E-Protein enthalten Signalsequenzen, welche zur Lokalisation im Bereich der Knospung führen. Dadurch erfolgt eine Inkorporation dieser Strukturproteine in neugebildete Viruspartikel. Insbesondere für den Einbau der S-Proteine ist die Interaktion mit dem M-Protein essentiell. S-Proteine bestehen aus einer Ektodomäne, einer Transmembrandomäne, sowie einer zytoplasmatischen Domäne, wobei letztere eine Cystein-reiche und eine ladungsreiche Region besitzt. Zudem weisen einige Vertreter ein Tyrosin-basiertes Motiv innerhalb der ladungsreichen Region auf, welches zur intrazellulären Retention oder Akkumulation führen kann. Es ist bekannt, dass der zytoplasmatische Abschnitt, besonders die ladungsreiche Region des S-Proteins des Maus Hepatitis Virus, sowie des SARS-CoV bei der Interaktion mit M-Proteinen eine essentielle Rolle spielt. In dieser Arbeit wurde die zytoplasmatische Domäne diverser CoV S-Proteine bezüglich des Zusammenspiels mit M-Proteinen untersucht. Die ladungsreiche Region des TGEV S-Proteins wurde dabei durch analoge Sequenzen, von humanen CoV und Fledermaus-CoV S-Proteinen stammend, ersetzt. Hierbei wurden Sequenzen von Vertretern der Gattungen Alpha- und Betacoronavirus gewählt. Abhängig von der Aminosäurensequenz der ladungsreichen Region beziehungsweise dem Vorhandensein von Sortierungssignalen, wie z.B. eines Tyrosin-basierten Signals, wurden in Einzelexpression unterschiedliche Expressionsverhalten für die validierten S-Proteine detektiert. Dennoch war die Interaktion mit dem TGEV M-Protein weder komplett zerstört noch beeinträchtigt. In den Zellen, die S- und M-Proteine co-exprimierten, wurde das S in der Nähe des Zellkerns und der M-Proteine beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass ein Aminosäurenaustausch weder im Tyrosin-basierten Motiv, noch innerhalb der ladungsreichen Region von CoV S-Proteinen die Interaktion mit M-Proteinen beeinflusst. Zusätzlich wurden drei TGEV M Y/A Konstrukte, mit mutierten Tyrosinen innerhalb der zytoplasmatischen Domäne, kloniert und für S-M Interaktionsstudien verwendet. Alle getesteten TGEV M Y/A Proteine führten zum Rückhalt des S-Proteins in co-exprimierenden Zellen. Allerdings erschien die S-M Interaktion leicht beeinträchtigt, da im Gegensatz zur Co-Expression von TGEV S und TGEV Mwt weniger S-Protein in der Zelle zurückgehalten wurde.