MicroRNAs as biomarkers in the host response to influenza A virus infection in humans and animals

Influenza A Viren (IAV) gehören zu der Familie der Orthomyxoviridae. Als Genom besitzen sie einzelsträngige RNA mit negativer Polarität. IAVs waren die Auslöser für drei große Pandemien im letzten Jahrhundert: 1918 A/H1N1; 1957 A/H2N2; und 1968 A/H3N2. Der Erreger einer vierten Pandemie 2009 war ein H1N1 Virus mit einem dreifachen Reassortment. Der Subtyp H5N1 beinhaltet das hoch pathogene aviäre Influenza Virus (HPAI), welches eine hohe Letalität in Vögeln aufweist, aber auch andere Spezies, einschließlich den Menschen, infizieren kann. MicroRNAs (miRNAs) sind kurze, nichtkodierende RNAs (small noncoding RNAs, sncRNAs) und spielen eine wichtige Rolle in der Feinregulierung der Genexpression. Unter pathologischen Bedingungen verändert sich die Expression der miRNAs und bietet dadurch einen vielversprechenden Ansatzpunkt in ihrem Gebrauch als Biomarker zur Bestimmung von Krankheiten und ihrem Verlauf. Ein besonderes Augenmerk richtet sich dabei auf IAV Ausbrüche in der Nutzierhaltung, wo diese kleinen Moleküle erste Krankheitsfälle aufspüren und eine weitere Ausbreitung verhindern könnten. Meine Doktorarbeit zielte darauf ab, die Bedeutung der miRNAs in der Wirtszellantwort auf IAV in Menschen und Tieren zu untersuchen und bestimmte miRNAs zu identifizieren, die als potentielle Biomarker nützen könnten. Vor den ersten Experimenten habe ich eine ausgiebige Literatursuche gemacht, um einen Überblick über die aktuell bekannte Rolle der Wirts-miRNAs in viralen Infektionskrankheiten, die für die Veterinärmedizin bedeutend sind, zu bekommen. Ein weiteres Ziel der Literaturrecherche war, Perspektiven und Hindernisse in dem Gebrauch von sncRNAs, insbesondere miRNAs, zur Kontrolle und Prävention von viralen Krankheitsausbrüchen mit Auswirkungen auf die Nutztierhaltung zu identifizieren. Diese Recherchen ergaben zwei Übersichtsartikel (Manuscript I und Manuscript II). In dem ersten Teil der experimentellen Arbeit (Abschnitt 4.1 in Unpublished data) habe ich mittels Reverse Transkriptase Echtzeit-PCR (RT-qPCR) die durch Sequenzierungstechnologie der Nächsten Generation (next generation sequencing, NGS) gewonnenen Daten überprüft, und zwar in Bezug auf die relativen Expressionsspiegel eines ausgesuchten Sets von miRNAs. Diese ausgewählten miRNAs wurden zuvor von Dr. Matthias Preuße (Helmholtz Zentrum für Infektionskrankheiten)  im Zusammenhang mit einer Krankheitsempfänglichkeit gegenüber PR8 H1N1 in Mäusen identifiziert. Das Ergebnis war eine hohe Übereinstimmung der beiden Herangehensweisen, was dafür spricht, dass RT-qPCR eine geeignete Methode ist, um NGS-Ergebnisse zu bestätigen. In dem zweiten Teil der Doktorarbeit (Manuscript III), habe ich in vitro Assays mit humanen Zelllinien etabliert, um die Zellart-spezifische Expression von miRNAs nach Stimulierung mit Agonisten von Toll-ähnlichen Rezeptoren (toll like receptors, TLR) oder nach Infektion mit Influenzaviren zu untersuchen. Infiziert wurden die Zellen mit zwei verschiedenen Influenzaviren, einem Wildtyp der Pandemie 2009 (swine-origin influenza virus, S-OIV wt) und einer reassortierten Variante (S-OIV NS PR8), der das NS Segment des PR8 H1N1 Virus trägt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass S-OIV NS PR8 eine Zellart-abhängige Veränderung bestimmter miRNAs hervorruft (miR-223 und miR-155), verglichen mit dem S-OIV wt. Die Infektion mit beiden Influenzatypen führte zu einer höheren Expression der miRNAs in humanen Lungenepithelzellen (A549) verglichen mit Makrophagen ähnlichen Zellen (dTHP-1). Die Stimulation mit TLR Agonisten (LPS and R848) ergab ein umgekehrtes Bild. Der dritte Teil meiner Doktorarbeit (Manuscript IV und Manuscript V) zielte darauf hin, die miRNA-Antwort auf Infektion mit dem Virus HPAI H5N1 in einem natürlichen Wirt zu untersuchen. Dafür wurde eine native Entenrasse (Anas platyrhynchos) mit A/chicken/Faquos/amn12/2011 (H5N1) Virus infiziert, einem ägyptischen Isolat, das nach einer phylogenetischen Analyse der Klade 2.2.1.2. zugehörig ist. Die erste virologische Untersuchung ergab niedrigere virale Transkription, Wachstumsrate und Pathologische Veränderungen im Gehirn verglichen mit anderen Organen, insbesondere der Lunge. Da diese Ergebnisse darauf deuteten, dass es eine organspezifische Wirtsantwort auf HPAI H5N1 Infektion gibt, wurde nun NGS (small RNA sequencing, small RNA-seq) eingesetzt, um die Hypothese zu testen, dass in diesen Organen spezifische miRNA-Antworten nachzuweisen sind. Als Ergebnis dieser Untersuchung war zu sehen, dass in den Lungen die miRNA Umprogrammierung insgesamt stärker ausfiel und früher stattfand, als im Gehirn. Der Maximalwert der miRNA-Antwort wurde in beiden Organen im späten Infektionsstadium (72-120 hpi) erreicht, nach dem Höchstwert der viralen Transkription. Daraus lässt sich schließen, dass die miRNA-Umprogrammierung einen Teil der Wirtsantwort im Gewebe auf die virale Transkription, die Replikation, darstellt. Des Weiteren wurden allgemeine und organspezifische miRNAs identifiziert, die eine charakteristische Gruppen bildeten, unter anderen miR-183, miR-194, miR-205 und miR-215. Gene, die für die Differenzierung von T-Helferzellen und die Regulation von JUN-Kinase Aktivität verantwortlich sind, waren in beiden Organen hochreguliert. Obwohl einige Signalwege, wie MAPK und Jak-STAT, in beiden Organen aktiviert wurden, war die Aktivierung in der Lunge höher als im Gehirn. Insgesamt  ergibt sich der Hinweis auf eine Beteiligung der miRNAs in der Organ-spezifischen Antwort auf HPA H5N1 und auf eine regulatorische Funktion der viralen Replikation in verschiedenen Geweben der Ente. Des Weiteren weist diese Studie auf die Möglichkeit des zukünftigen Gebrauchs von miRNA als potentielle Biomarker bei der IAV Infektion hin. Im letzten Teil meiner Doktorarbeit (Abschnitt 4.2 in Unpublished data), etablierte ich ein humanes Lungenexplantat-Modell (human lung tissue explant, HLTE), um den Effekt des reassortierten NS Segments auf die virale Replikation und die Wirtsexpression von miRNAs in einem humanen Geweben ex vivo zu untersuchen. Dieses Modell ermöglicht eine Annäherung der gegenwärtigen Infektionsmodelle an die Infektion beim Menschen. Hierfür verwendete ich die beiden in Manuscript III beschriebenen Viren (S-OIV wt und S-OIV NS PR8). Die erste Etablierung des HLTE Modells führte zu einer Replikation von beiden Viren. Die NS Reassortierung  führte zu einer Erhöhung der viralen Transkription, besonders nach 8 und 48 hpi. Dies wurde begleitet von einer Steigerung der IFN-α mRNA- und Protein-Expression. Ein weiteres Ergebnis waren verstärkte Endothelzellschäden und Epithelzellablösungen durch S-OIV NS PR8, verglichen mit dem S-OIV wt. Zusammengefasst lassen meine Ergebnisse darauf schließen, dass miRNAs eine Schlüsselrolle in der Wirtsantwort auf unterschiedliche IAV Typen spielen. Sie weisen zellart- und organspezifische Expression und Funktionen auf. Die Untersuchung der miRNA-Antwort auf HPAI H5N1 in einem natürlichen Wirt, d.h. der Ente, ist hilfreich, um Schlüsselprozesse von Krankheitsempfänglichkeit und Übertragbarkeit auf Menschen zu identifizieren. Des Weiteren weisen die Ergebnisse auf die vielversprechende Rolle der miRNAs als wirtsbezogene Biomarker bei IAV Infektionen hin.