The Libechov Minipig as a transgenic animal model for preclinical research in Huntington’s Disease
Huntington’s disease (HD) is an inherited neurodegenerative disorder in humans. It is caused by a Cytosin-Adenin-Guanin (CAG) triplet repeat expansion of ≥ 36 in the IT-15 gene on chromosome 4, and follows an autosomal-dominant trait. HD is characterized by motor, cognitive and behavioral symptoms. Choreatic movements, dementia and depression are core manifestations. The symptoms are caused by the mis-folded mutant protein Huntingtin (mHTT) leading to cell death particularly of neurons within the cerebral cortex, the caudate nucleus and the putamen. To investigate the pathways of HD, several transgenic and knock-in animal models have been established. While a lot of research has been conducted with rodents and invertebrates like mice and rats, drosophila, and Caenorhabditis elegans, this work deals with transgenic minipigs. The tgHD (transgenic HD) Libechov minipig model is one of a few large animal models (sheep, monkeys) created to explore the safety and tolerability of novel therapeutic approaches for HD prior to studies in humans. Because of the high homology between humans and pigs and their similar brain structure the tgHD Libechov minipig was chosen. It was created using lentiviral transduction, and expresses an N-terminal truncated form of human huntingtin with 124 CAG/CAA repeats on chromosome 1. This study aimed to develop a novel Phenotyping Battery that could detect symptoms in tgHD Libechov minipigs, resembling those seen in human HD. The Phenotyping Battery should be capable of assessing the motor, cognitive and behavioral phenotype of these animals. The goal for this model is to bridge the gap between preclinical research in rodents and clinical studies in humans. Advantages and limitations of using minipigs as a large animal model were considered, especially with regards to breeding, housing, handling, and with respect to homology to humans as well as ethical considerations. A group of 17 tgHD and 19 wildtype (wt) female minipigs (n=36) was used to gain first evidence of the tgHD minipig phenotype. The animals were available for the following motor, cognitive and behavioral assessments: A gait test using the GAITRite® (automated acquisition system), the Hurdle Test, the Tongue Test, the Discrimination Test, the Startbox back and forth Test and the Dominance Test. Each test was performed biannually. All tests were safe, well tolerated and feasible. Furthermore annual MRI scans were performed, including anatomical, spectroscopic and diffusion weighted imaging (DWI) sequences. However, the imaging data are not part of this thesis. Group comparisons showed no differences in cognitive, motor and behavioral tests between tgHD and wt minipigs up to an age of three years. Variability of the tests was low within and between groups.
Die Huntington’sche Krankheit (HK) ist eine dominant vererbte, neurodegenerative Erkrankung des Menschen. Sie ist gekennzeichnet durch Verhaltensauffälligkeiten sowie progressive kognitive und motorische Defizite. Kernsymptome sind choreatische Bewegungen, Demenz und Depressionen. Die HK tritt bei mindestens 36 aufeinanderfolgenden Wiederholungen des Basentripletts Cytosin-Adenin-Guanin (CAG) auf dem Chromosom 4 auf und ist somit eine Trinukleotiderkrankung. Die erhöhte Anzahl an CAG-Wiederholungen führt zu einem fehlerhaften Protein, dem mutierten Huntingtin. Dieses verursacht Zelltod, insbesondere der Neuronen in der Großhirnrinde, dem Nucleus caudatus und dem Putamen. Eine Vielzahl an transgenen Tiermodellen und Knock-In-Tieren wurde bereits etabliert, um die HK zu erforschen. Die bisherigen präklinischen Studien wurden hauptsächlich an Nagetieren und Invertebraten durchgeführt (z.B. Mäuse, Ratten, Drosophila und Caenorhabditis elegans). Leider konnten die Ergebnisse nicht erfolgreich in die Klinik übertragen werden. Im Fokus steht nun die Entwicklung von dem Menschen ähnlichen Großtiermodellen, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Translation zu erhöhen. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung des transgenen Libechov Minipigs als Großtiermodell für die HK. Die Homologie zwischen Mensch und Minipig, besonders in Hinblick auf das Gehirn, war ausschlaggebend für die Wahl des Tiermodells. Das Minipig wird in dieser Arbeit kritisch auf die Eignung für dieses Vorhaben diskutiert mit Hauptaugenmerk auf Zucht, Haltung, Handling, Homologie zum Menschen und ethischer Vertretbarkeit. Neben der Beurteilung des Libechov Minipigs als Tiermodell für die HK wurde eine neue, auf Großtiere zugeschnittene Testbatterie zur Phänotypisierung entwickelt. Diese basiert auf Grundlage des UHDRS (Unified Huntington’s Disease Rating Scale), einer Bewertungsskala zur Bestimmung der Krankheitsintensität beim Menschen. Die Testbatterie dient der Erfassung des motorischen, kognitiven und verhaltensbiologischen Phänotyps der Tiere. Ziel ist es, die Lücke zwischen präklinischer Forschung in Nagetieren und klinischer Forschung im Menschen zu schließen. Das transgene Libechov Minipig wurde durch lentivirale Transduktion erschaffen und exprimiert das N-terminale Ende des humanen Huntingtins mit einer Triplet-Länge von 124 CAG/CAA auf dem ersten Chromosom. Eine Gruppe von weiblichen Libechov Minipigs, bestehend aus 17 transgenen Tieren und 19 Wildtypen, war für die Phänotypisierungsstudie verfügbar. Die 36 Tiere absolvierten die Testbatterie, bestehend aus folgenden Assessments, halbjährlich: GAITRite, Hürden-Test, Zungen-Test, Unterscheidungstest, Startbox-vor-und-zurück-Test und Dominanz-Test. Sowohl die transgenen Minipigs als auch die Wildtypen konnten die Tests erfolgreich bewältigen. Neben der Durchführung der Testbatterie wurden jährliche MRTs von den Gehirnen der Tiere angefertigt. Die MRT-Aufnahmen setzten sich aus anatomischen Messungen, Spektroskopien und diffusionsgewichteter Bildgebung zusammen. Die Bildgebung ist nicht Teil dieser Dissertation. Die Gruppenvergleiche zeigten bis zu einem Alter von drei Jahren keine Unterschiede in den kognitiven, motorischen und verhaltensbiologischen Assessments zwischen den transgenen Tieren und der Kontrollgruppe. Die Variabilität der Tests war gering.
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Schramke, Sarah: The Libechov Minipig as a transgenic animal model for preclinical research in Huntington’s Disease. Hannover 2016. Tierärztliche Hochschule.
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