Induced oxidative stress in stallion sperm: effects on osmotic resistance and cryosurvival

Reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species = ROS), wie das Superoxidanion (∙O2-), Wasserstoffperoxid (H2O2) und das Hydroxylradikal (∙OH), sind Produkte des physiologischen, oxidativen Metabolismus von Spermien. Zusätzlich können bei der Aufbereitung und Lagerung von Spermienproben schädigende Reaktionen auftreten, die zur Entstehung von ROS führen können. ROS können bei einer Imbalanz zwischen Produktion und Abbau akkumulieren und mit Biomolekülen, insbesondere Phospholipiden der Plasmamembran, reagieren und diese in ihrer Struktur und Funktion beeinträchtigen. Dieses Phänomen wird auch als oxidativer Stress bezeichnet, der die Spermienmotilität, sowie die Plasmamembran- und Chromatinintegrität beeinträchtigen kann.             Das Ziel des ersten Teils dieser Dissertation war es mittels Xanthin (X) und Xanthinoxidase (XO) definierte Mengen von ROS und oxidativem Stress in Hengstspermien zu induzieren, das Vorkommen von intrazellulärer ROS- Akkumulation zu überprüfen und Effekte von sublethalem, oxidativem Stress auf die Motilitätsparameter, die Plasmamembran- und Chromatinintegrität sowie auf die Toleranz von Hengstspermien gegenüber hypoosmotischem Stress zu untersuchen. Die Spermienproben wurden in mit X/XO versetzten Verdünner für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend entweder analysiert oder der gekühlten Lagerung oder Kryokonservierung zugeführt. Die Spemienmotilität wurde durch computer- assistierte Spermienanalyse ermittelt, wohingegen das mitochondriale Membranpotential und die Plasmamembranintegrität mittels flowzytometrischer Analyse von jeweils JC1- und SYBR/PI- gefärbten Spermienproben untersucht wurden. Die Chromatinintegrität wurde mit dem Spermien-Chromatin-Struktur-Assay (SCSA) ermittelt. Die Akkumulation von ROS wurde flowzytometrisch als H2DCFDA-abgeleitete Fluoreszenz in membranintakten Spermien bestimmt. Es wurde bestätigt, dass die Behandlung mit steigenden X/XO- Konzentrationen in definiert ansteigenden Mengen von ROS- Akkumulation resultiert. Die mikroskopischen Untersuchungen zeigten eine Akkumulation von ROS (bzw. den mit ROS reagierten Farbstoffen) überwiegend im Mittelstück der Spermien. Es wurde zudem festgestellt, dass eine Behandlung mit X/XO zu einer dosisabhängigen Verminderung der Anzahl motiler Spermien und Spermien mit einem hohen mitochondrialen Membranpotential führt. Unter den in dieser Studie verwendeten Bedingungen blieben die Plasmamembran- und Chromatinintegrität unbeeinflusst bei Verwendung von bis zu 150 mU mL-1 XO. Dies deutet darauf hin, dass der induzierte oxidative Stress subletal ist. Die Toleranz von Spermien gegenüber hypotonem Stress wurde durch den Vergleich der Membranintaktheit nach Verdünnung mit hypotoner Kochsalzlösung bestimmt. Es konnte eine Verminderung der hypoosmotischen Resistenz der Spermien mit steigenden, subletalen Konzentrationen induzierter ROS festgestellt werden.             Im zweiten Teil dieser Dissertation wurden Effekte von verschiedenen induzierten ROS- Konzentrationen auf die Spermienqualität während gekühlter Lagerung und Kryokonservierung untersucht. Des Weiteren wurde die Korrelation zwischen der hypoosmotischen Toleranz der Spermien vor dem Einfrieren und deren Überlebensrate nach dem Auftauen bestimmt. Während gekühlter Lagerung zeigten die Spermienmotilität und die hypoosmotische Resistenz eine deutlichere Verminderung nach X/XO- Behandlung und mit steigenden intrazellulären ROS- Konzentrationen. Die Entfernung von X/XO aus der Lösung durch Zentrifugation und Ersatz mit frischem Verdünner, führte zu einem Abfall der H2DCFDA-abgeleiteten Fluoreszenzintensitäten in membranintakten Spermien auf ähnliche Niveaus wie in den unbehandelten Proben. Die Membran- und Chromatinintegrität zeigten unter den verwendeten Bedingungen keinen deutlichen Abfall während gekühlter Lagerung und mit steigenden X/XO- Konzentrationen. Daraus folgt, dass die induzierten ROS-Mengen als subletal bewertet werden können. Auch nach Kryokonservierung war die Reduktion von membranintakten und motilen Spermien deutlicher nach X/XO- Behandlung. Wenn definierte Mengen von oxidativem Stress mittels X/XO vor der Kryokonservierung induziert wurden, konnte eine Korrelation zwischen der hypoosmotischen Toleranz vor dem Einfrieren und der Überlebensrate der Spermien nach dem Auftauen festgestellt werden.             Das Ziel des letzten Teiles dieser Dissertation war es zu testen, ob die Supplementation von Antioxidantien (α-Tocopherol/Vitamin E, Katalase) oder eine Aufbereitung mittels Zentrifugation geeignet sind, um der induzierten, oxidativen Schädigung entgegen zu wirken und die Überlebensrate der Spermien nach dem Auftauen zu erhöhen. Mit dem hier verwendeten Versuchsaufbau konnte durch Zugabe von Katalase oder Vitamin E nach induziertem oxidativem Stress, der Anteil membranintakter und motiler Spermien vor dem Einfrieren und nach Kryokonservierung nicht signifikant erhöht werden. Die Entfernung von X/XO aus der Lösung mittels Zentrifugation und Ersatz mit frischem Verdünner resultierte in ähnlichen Niveaus von H2DCFDA-abgeleiteten Fluoreszenzintensitäten in membranintakten Spermien, wie in unbehandelten Proben.             Zusammenfassend kann die Inkubation von Hengstspermien mit X/XO benutzt werden, um definierte Mengen reaktiver Sauerstoffspezies zu induzieren. Die Motilität und hypoosmotische Resistenz von Hengstspermien werden durch subletale Mengen von oxidativem Stress negativ beeinflusst. Die Verwendung von X/XO zur Induktion von oxidativem Stress kann eine geeignete Methode für weiterführende Studien von oxidativer Spermienschädigung während Aufbereitung und Lagerung, sowie für die Prüfung von Effekten von Verdünnerzusätzen auf die Spermienqualität, darstellen.