Etablierung spezifischer PCR und qPCR-Assays zur Analyse der Genexpression caniner Claudine-1, -3, -4 und -7 sowie deren longitudinale Gen- und Proteinexpression in Primärkulturen und Zelllinien von Mamma- und Prostatatumoren

Hammer, Susanne Conradine

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Etablierung spezifischer PCR und qPCR-Assays zur Analyse der Genexpression caniner Claudine-1, -3, -4 und -7 sowie deren longitudinale Gen- und Proteinexpression in Primärkulturen und Zelllinien von Mamma- und Prostatatumoren

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Die Claudin Proteine sind ein struktureller und funktioneller Bestandteil der Tight Junctions des epithelialen Gewebes. Sie zeigen in Tumoren des Menschen im Vergleich zum gesunden Gewebe Deregulierungen ihrer Gen- und Proteinexpression. Beim Hund ist ebenfalls eine veränderte Expression der Claudin Proteine in Tumoren bekannt. Auf Genebene gibt es für den Hund bisher keine Erkenntnisse. Einige der Claudin Proteine fungieren als Rezeptor für das Enterotoxin des Bakteriums Clostridium perfringens (CPE), wodurch Claudin-exprimierende Zellen mithilfe des CPEs angesteuert und abgetötet werden können. Um solche Verfahren für Tumoren des Hundes zu entwickeln, ist das Vorhandensein von Claudin-exprimierenden Zelllinien eine Voraussetzung. Um die Genexpression der Claudine-1, -3, -4 und -7 in Tumoren des Hundes untersuchen zu können, wurden im Rahmen der vorliegenden Studie PCR / qPCR Assays etabliert. Mit diesen PCR / qPCR Assays wurde die Claudin Genexpression von drei caninen Prostatatumor-Zelllinien (ein Übergangszellkarzinom, zwei Adenokarzinome) und drei weiteren Zelllinien, welche sich vom Gewebe des Gesäuges von Hündinnen (gesund, Adenom, Karzinom) ableiten, untersucht. Zwei der Prostatatumor-Zelllinien (die des Übergangszellkarzinoms, eine eines Adenokarzinoms) exprimierten die Claudine-1, -3, -4 und -7, die Mammaadenom-Zelllinie exprimierte das Claudin-1. Die zweite Prostata-Adenokarzinom-Zelllinie sowie die Zelllinie des gesunden Gesäuges und die des Karzinoms waren negativ für die untersuchten Claudin Gene. Die Claudin-Negativität der caninen Zelllinien des Gesäuges steht im Gegensatz zu dem Nachweis der Claudin Proteine aus der gesunden Gesäugeleiste des Hundes sowie benignen und malignen Tumoren. Die selbst generierten Daten und Studien anderer geben Hinweise darauf, dass sich in Zelllinien ursprünglich Claudin-exprimierender Gewebe die Claudin Expression vermindert. Dies schränkt die universelle Anwendung von Zelllinien für die Entwicklung Claudin-basierter Tumor-therapeutischer Methoden ein. Um geeignete Zelllinien zu finden, wurden daher aus 17 frisch gewonnenen Proben der caninen nicht-neoplastischen und neoplastischen Gesäugeleiste Primärkulturen angesetzt. Waren die Primärkulturen über die 19. Passage hinaus kultivierbar, wurden sie als Zelllinien bezeichnet. Die Claudin Expression wurde in den Primärkulturen bis zum Erreichen der letzten vitalen Passage und in den Zelllinien bis zur 30. Passage während der Kultivierung longitudinal untersucht. War von einer Probe genügend Ausgangsmaterial vorhanden, wurde auch die Probe auf ihre Claudin Expression untersucht und mit der Expression der zuerst daraus kultivierten Zellen verglichen. Der Vergleich der Originalprobe zu Zellen, die daraus kultiviert wurden, zeigte, dass die Zellen zu Beginn der Kultivierung bereits eine geringere Claudin Expression vorwiesen. Entsprechend verloren alle Primärkulturen und die Mehrheit der neu etablierten Zelllinien im Verlauf der Kultivierung Claudin Gen- und Proteinexpression. Eine Zelllinie eines Adenoms der Gesäugeleiste dagegen exprimierte die Claudine-1, -4 und -7. Bei einer Zelllinie einer Hyperplasie und einer Zelllinie eines Karzinoms blieben die Claudine-1, -3, -4 und -7 stabil exprimiert. Diese Zelllinien, sowie die Claudin exprimierenden Prostatatumor-Zelllinien des Hundes, können zukünftig zur Prüfung Claudin-basierter Tumortherapien eingesetzt werden.

Claudin proteins are a structural and functional part of the tight junctions of epithelial tissues. Human tumours compared to healthy tissues show deregulations of their claudin gene and protein expression. Such deregulations of claudin proteins are also known for canine tumours, but claudin gene expression analyses have not yet been performed. Some of the claudin proteins act as receptor for the enterotoxin of Clostridium perfringens (CPE), enabling the targeting and killing of claudin-expressing cells. For the development of such strategies for canine tumours, canine claudin expressing cell lines need to be found. The establishment of PCR / qPCR assays that enable claudin gene expression analyses was performed in this study. These assays were used to analyse the claudin gene expression of three canine prostate tumour derived cell lines (two prostate adenocarcinomas, one transitional cell carcinoma) and three canine mammary tissue derived cell lines (healthy, adenoma, carcinoma). Two of the prostate tumour derived cell lines (one adenocarcinoma derived, the other transitional cell carcinoma derived) showed expression of the claudins-1, -3, -4 and -7, the mammary adenoma derived cell line expressed claudin-1. The second prostate adenocarcinoma derived cell line, the healthy mammary tissue and the mammary carcinoma derived cell lines were negative for the analyzed claudins. The claudin-negativity of the canine mammary tissue derived cell lines is contrary to claudin expression in the healthy mammary gland and benign and malignant tumours. The own conducted study and reports of others indicate, that cultivated cells show a diminished claudin expression, limiting the use of cell lines for testing claudin-targeting antitumor-therapies. To identify such cell lines, primary cultures were generated from 17 canine non-neoplastic and neoplastic mammary gland samples in this study. If the primary cultures were cultivable beyond passage 19, they were designated as cell line. The claudin expression was longitudinally analysed in the primary cultures until the last viable passage and in the cell lines for a cultivation period of 30 passages. If there was enough material from one sample, the claudin expression of the sample was also analyzed and compared to the expression of the freshly cultivated cells. The comparison of claudin expression in the original tissue und cultivated cells showed, that cultivated cells have a lower claudin expression than the original sample. Accordingly, all primary cultures and the majority of the generated cell lines lost expression of the claudin-1, -3, -4 and -7 genes and proteins. One cell line derived from a mammary adenoma expressed the claudins-1, -4 und -7. A cell line derived from a hyperplasia and a cell line derived from a carcinoma kept stable expression of all analyzed claudins-1, -3, -4 und -7. These cell lines and the claudin-expressing prostate tumour derived cell lines can be used for testing claudin-targeting antitumor therapies.