Untersuchung des Biofilmbildungsvermögens euterpathogener Mikroorganismen
Bovine mastitis is one of the most common diseases in dairy cows, and it causes financial losses through both reduced milk yields and therapy costs. In addition, there is a negative effect on the welfare of affected animals. The majority of mastitis cases are treated with antibiotics to achieve bacterial cure. Bacterial cure is influenced by animal-specific factors, such as the age of a cow, the somatic cell count, and the duration of infection, as well as by farm management and animal husbandry. In addition, the mastitis-causing pathogen has an influence on the cure rate. The ability of the pathogens to form biofilms is considered to be one cause of persistent or recurrent infections. Biofilm-associated infections are also of major importance in human medicine, so guidelines for the diagnosis and therapy of biofilm-associated infections have been developed. Under certain conditions, pathogens with this virulence factor express the genes responsible for biofilm formation. They then become attached to a surface and are surrounded by a self-produced matrix, which protects them against attack by the immune system and against the effects of antibiotics and disinfecting agents. Since the cure rates for bovine mastitis vary considerably depending on the causative pathogen, the first goal of this work was to investigate the ability of mastitis-causing pathogens to form biofilms. The question of whether biofilms are responsible for the comparatively low cure rates in S. aureus infections was investigated. The two applied in vitro tests showed that in the pathogen groups tested, a similarly high proportion of mastitis-causing pathogens were capable of biofilm formation. Many biofilm-positive strains were also found among the pathogens that show significantly higher cure rates in comparison with S. aureus. The results thus show that biofilm formation cannot be the main cause for the differences in cure rates. The results from Congo red agar were compared with the outcomes of the Tube Test, which is reported in literature as a reliable biofilm detection method. It became apparent that the Congo red agar method shows deficiencies, particularly in the detection of biofilm-negative strains, with the result that it cannot be recommended as a sole detection method. Previous studies have shown that biofilm formation is influenced by the surrounding environment. Not all strains that are genetically capable of biofilm formation activate this protective mechanism at all times. It can be concluded that the in vitro results give an indication of the percentage share of the strains capable of biofilm formation, but they do not necessarily reflect the situation in mastitis. The second part of this work was aimed at investigating whether biofilms are found in mastitis on mammary gland epithelium. Initially, the study was restricted to S. aureus mastitis. This was done firstly because S. aureus infections are known for their low cure rates. Secondly, the vaccine Startvac®, distributed by the company HIPRA, is based on a component of the S. aureus biofilm, and we wanted to check whether this antigen is present in S. aureus infected mammary gland. Through an indirect immunofluorescence assay, the staphylococcus biofilm component polysaccharide intercellular adhesin [PIA; also known as poly-N-acetyl-β-(1,6)-glucosamine (PNAG)], which is the antigen that the Startvac® vaccine is based on, was visualised in swabs taken from different areas of infected quarters. Green fluorescence indicated the presence of PIA in swabs from teat cistern and gland cistern as well as in smears of mammary gland parenchyma. The simultaneously performed negative and positive control samples showed the expected results, thus indicating correct functioning of the method. Overall, the results demonstrate that in S. aureus mastitis, biofilms containing PIA are formed by the pathogen on the mammary gland epithelium. This confirms that the target of the vaccine Startvac® occurs in S. aureus mastitis. The detection of biofilms is only the first step on the way to clarifying to what extent this protective layer produced by the pathogens actually affects the therapy of mastitis, and further studies are required. The present work contributes to our understanding of biofilms in medicine, which has been a topic of interest for several years, and the associated consequences in the field of bovine mastitis.
Die Mastitis des Rindes ist eine der häufigsten Erkrankungen bei Milchkühen, die finanzielle Einbußen durch Milchverlust und Therapiekosten verursacht. Darüber hinaus wird das Wohlbefinden des Tieres beeinträchtigt. Die meisten Mastitisfälle werden mit Antibiotika behandelt, um eine bakteriologische Heilung, die Elimination eines Erregers zu erreichen. Diese wird durch tierindividuelle Einflussfaktoren wie das Alter einer Kuh, der somatische Zellgehalt oder die Infektionsdauer ebenso beeinflusst wie durch das Management im Betrieb und die Haltung. Doch auch der Mastitis verursachende Erreger hat Einfluss auf die Heilungsrate. Die Fähigkeit zur Biofilmbildung gilt als ein Grund für persistierende oder rezidivierende Infektionen. Biofilm-assoziierte Infektionen (BAI) sind auch in der Humanmedizin von großer Bedeutung, sodass Richtlinien für die Diagnostik und Therapie von BAI entwickelt wurden. Pathogene mit diesem Virulenzfaktor exprimieren unter bestimmten Bedingungen die für die Biofilmbildung verantwortlichen Gene. Sie liegen dann angeheftet an einer Oberfläche und umgeben von einer selbstproduzierten Matrix, geschützt gegen Angriffe des Immunsystems und gegen die Wirkung von Antibiotika und Desinfektionsmitteln. Da sich die Heilungsraten boviner Mastitiden, je nach auslösendem Erreger, zum Teil erheblich unterscheiden, war das erste Ziel dieser Arbeit, Mastitiserreger auf ihre Fähigkeit zur Biofilmbildung zu untersuchen. Es wurde der Frage nachgegangen, ob Biofilme für die vergleichsweise niedrigen Heilungsraten bei S. aureus verantwortlich sein könnten. Die zwei angewendeten In-vitro-Tests kamen bei allen Pathogengruppen insgesamt auf einen ähnlich hohen Anteil von Mastitiserregern, die zur Biofilmbildung fähig waren. Auch unter den Erregern, die im Vergleich zu S. aureus deutlich höhere Heilungsraten aufweisen, waren viele Biofilm-positive Stämme zu finden. Die Studie brachte die Erkenntnis, dass die Biofilmbildung nicht der Hauptgrund für die Unterschiede bei den Heilungsraten sein kann. Die Resultate des Kongorot Agars wurden mit denen des Tube Tests verglichen, der in der Literatur als zuverlässige Biofilmdetektionsmethode beschrieben wird. Dabei stellte sich heraus, dass der Kongorot Agar besonders im Auffinden Biofilm-negativer Stämme Defizite aufweist, sodass er nicht als alleiniges Verfahren empfohlen werden konnte. Bisherige Studien haben gezeigt, dass die Ausbildung eines Biofilms von dem umgebenden Milieu beeinflusst wird. Nicht alle Stämme, die genetisch zur Biofilmbildung in der Lage sind, bilden zu jeder Zeit diesen Schutzmechanismus aus. Es wurde geschlussfolgert, dass die In-vitro-Ergebnisse einen Hinweis auf den prozentualen Anteil der zur Biofilmbildung befähigten Stämme geben, diese aber nicht zwangsläufig das Bild bei einer Mastitis widerspiegeln müssen. Der zweite Teil dieser Arbeit zielte darauf ab aufzudecken, ob bei einer Mastitis Biofilme auf dem Milchdrüsenepithel zu finden sind. Dabei wurde sich vorerst auf S. aureus-Mastitiden beschränkt. Einerseits, weil S. aureus-Infektionen für ihre niedrigen Heilungsraten bekannt sind. Zum anderen, um zu überprüfen, ob die Komponente, auf welcher der von der Firma HIPRA vertriebene Impfstoff Startvac® basiert, tatsächlich in einer S. aureus infizierten Milchdrüsen vorliegt. Über ein indirektes Immunfluoreszenzverfahren wurde in Abstrichen aus verschiedenen Bereichen eines infizierten Euterviertels der Staphylokokken-Biofilmbestandteil Polysaccharid Interzellular Adhäsin (PIA) sichtbar gemacht, der auch unter dem Namen Poly-N-Acetyl-β-(1,6) -Glukomsamin (PNAG) bekannt ist und der das Antigen darstellt, auf dem die Vaccine Startvac® basiert. Eine grüne Fluoreszenz zeigte das Vorhandensein von PIA sowohl in Abstrichen aus Zitzen- und Drüsenzisterne als auch in Abstrichen des Milchdrüsenparenchyms an. Die gleichzeitig durchgeführten Negativ-und Positivkontrollen kamen zu den erwarteten Ergebnissen und zeigten die korrekte Funktion der Methode an. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass bei S. aureus-Mastitiden Biofilme mit dem Bestandteil PIA vom Erreger auf dem Milchdrüsenepithel gebildet werden. Somit wurde belegt, dass das Target des Impfstoffs Startvac® bei S. aureus-Mastitiden vorkommt. Der Nachweis von Biofilmen ist nur der erste Schritt auf dem Weg zur Klärung, inwieweit diese Schutzschicht der Erreger tatsächlich die Therapie einer Mastitis beeinträchtigt. Dafür werden weitere Studien benötigt. Die vorliegende Arbeit trägt zum seit einigen Jahren relevanten Thema Biofilme in der Medizin und die damit einhergehenden Folgen im Bereich Mastitis des Rindes bei.
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Schönborn, Sarah: Untersuchung des Biofilmbildungsvermögens euterpathogener Mikroorganismen. Hannover 2017. Tierärztliche Hochschule.
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