Die Rolle der durch den Verzehr von rotem Fleisch endogen gebildeten Nitrosoverbindungen in der malignen Transformation von humanen Kolonepithelzellen
Colorectal Cancer (CRC) is the third most commonly diagnosed cancer worldwide. Every year more than 60.000 cases are diagnosed in Germany. The most important risk factors are age, a genetic predisposition and chronic inflammatory bowel diseases such as Morbus Crohn. Moreover, dietary factors are also involved in CRC development. In 2015 the International Agency for Research on Cancer (IARC) classified processed red meat as carcinogenic to humans. Because of limited experimental evidence, unprocessed red meat was classified as probably carcinogenic to humans. Until now, the mechanism by which these dietary compounds contribute to CRC induction is not fully understood. It is known that the endogenous formation of nitroso compounds (NOC) is the consequence of red meat consumption and that these NOCs are responsible for DNA alkylation in colonic epithelial cells. The lack of DNA repair leads to DNA mutations in genes that are known to be involved in important cellular processes such as proliferation and differentiation and an accumulation of several different gene mutations leads to CRC initiation and progression. One of the major differences between red and white meat is their myoglobin concentration and, therefore, this is one of the most interesting possible risk factors for CRC development. The heme moiety of myoglobin gets nitrosated during meat processing or is endogenously nitrosated by bacterial processes. NO-heme is an important nitrosating agent and among other compounds responsible for the formation of NOCs. NOCs are alkylating agents, acting directly or after their activation, and induce DNA lesions in colonic epithelial cells. NO-heme is consumed or endogenously formed and therefore one of the possible risk factors present in (processed) red meat. The first aim of this study was to analyze the effect of NO-heme on the human colon epithelial cell line HCEC and to determine whether NO-heme could lead to a malignant cell transformation. It is known that DNA lesions such as O6-MeG and O6-CMG can be induced by nitroso compounds. The O6-MeG is repaired by the O6-methylguanine methyltransferase (MGMT), while this seems not to be the case of the O6-CMG adduct. Because of this, it has been speculated that the O6-CMG adduct plays a particularly important role in the induction of genetic mutations during colon carcinogenesis. In 2013 it was shown for the first time that MGMT does not repair O6-CMG adducts, whereby it has to be mentioned that these experiments were performed in a cell-free system. Because of this, the second aim of this study was to investigate the role of MGMT in the repair of O6-CMG adducts in a human colon epithelial cell culture system. The results of this study confirmed the previous hypothesis that MGMT is indeed able to repair O6-CMG adducts. MGMT-deficient cells were much more sensitive towards the carboxymethylating agent azaserine than the wild-type (WT) cells. However, the preliminary results of the DNA adduct quantification also show that O6-MeG and O6-CMG adducts are still in part detected in WT cells, so that one has to assume that the efficiency of MGMT to repair O6-CMG adducts is lower than that to repair other guanine adducts. In earlier studies it was already speculated that nucleotide excision repair (NER) could also be involved in the repair of O6-CMG adducts. Taken together, it can be said that NER as well as MGMT seem to be involved in the repair of O6-CMG adducts. NO-Heme as a nitrosating agent is involved in the formation of nitroso compounds and, based on earlier findings, is expected to play an important role in colon carcinogenesis. The experiment in which HCEC cells are exposed once to NO-heme shows that this compounds is taken up by the cells and leads in them to nitrosative stress. Moreover, NO-heme is cytotoxic and genotoxic. However, a repeated exposure of the cells to NO-heme did not lead to the malignant transformation of the HCEC cells. Since further strongly mutagenic compounds were not able to malignantly transform the cells, one has to conclude that these cells, because of their pronounced genomic stability, are not an adequate cell transformation model. Because of this, the potential cell transforming capacity of NO-heme was tested in the BALB/c-3T3 cell transformation assay. In this test system, it could be shown that a repeated incubation of the cells with 10 µM NO-heme is able to transform them. This finding supports the hypothesis that NO-heme could be involved in colon carcinogenesis. Nevertheless, when analyzing these results one has to bear in mind that, following its synthesis, NO-heme was not extracted and further purified, so that it was not used in a highly purified form. Further reaction products and nitrite traces could have been present in the NO-heme preparation and might have contributed to a false-positive result. Future experiments with highly purified NO-heme and further human colon epithelial cell lines are needed to determine whether NO-heme is indeed involved in the malignant transformation of human colon epithelial cells.
Das kolorektale Karzinom (CRC) ist eines der häufigsten Krebsleiden weltweit. Allein in Deutschland erkranken jährlich mehr als 60.000 Menschen daran, wobei mehr Männer als Frauen davon betroffen sind. Das Alter sowie chronisch entzündliche Darmerkrankungen und eine genetische Prädisposition zählen zu den wichtigsten Risikofaktoren. Neben diesen Faktoren gibt es natürlich auch eine Reihe von Nahrungsmitteln und –bestandteilen, die die Entstehung des CRCs fördern können. Nach der Stellungnahme der „International Agency for Research on Cancer“ (IARC) Ende 2015 wird der Konsum von rotem Fleisch als einer der wichtigsten nahrungsmittelbedingten Risikofaktoren betrachtet. Des Weiteren klassifizierte die IARC verarbeitetes rotes Fleisch, wie beispielsweise Salami und Hot Dogs, als kanzerogen für den Menschen und aufgrund der bisherigen Datenlage unverarbeitetes rotes Fleisch als vermutlich kanzerogen für den Menschen. Daten aus vorangegangenen Arbeiten zeigen eine eindeutige Korrelation zwischen dem Konsum von (verarbeitetem) roten Fleisch und der Inzidenzrate von CRC, jedoch ist bisher nicht hinreichend erforscht worden, welche der Komponenten aus dem roten Fleisch hauptverantwortlich für die Entstehung des CRCs sein könnte. Bisher ist bekannt, dass der Konsum von rotem Fleisch zur endogenen Bildung von Nitrosoverbindungen führt, die wiederum die DNA der Kolonepithelzellen modifizieren können. Die dabei gebildeten DNA-Addukte können zu Mutationen in Genen führen, die wichtige Prozesse der Zelle regulieren. Eine Akkumulation dieser Genmutationen kann den Prozess der CRC-Entstehung vorantreiben und schlussendlich zum Tumor führen. Myoglobin bzw. dessen Häm-Komponente ist ein wesentlicher Bestandteil von rotem Fleisch und wird bereits beim Pökeln des Fleisches oder direkt im Gastrointestinaltrakt nitrosiert. NO-Häm nitrosiert wiederum Aminosäuren und führt somit zur Bildung von Nitrosoverbindungen, die die DNA der Epithelzellen alkylieren können. Darauf basierend kann NO-Häm als ein potenzieller CRC-Risikofaktor betrachtet werden. Aufgrund dessen wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die potenzielle zelltransformierende Wirkung von NO-Häm in humanen Dickdarmepithelzellen untersucht. Es ist bekannt, dass DNA-Läsionen wie O6-MeG und O6-CMG durch Nitrosoverbindungen induziert werden können. Repariert wird das O6-MeG-Addukt durch die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT). Im Fall des O6-CMG-Adduktes ging man bisher davon aus, dass es nicht von der MGMT repariert werden kann. Aus diesem Grund wird spekuliert, dass das O6-CMG-Addukt eine besonders wichtige Rolle in der Induktion von Genmutationen während der CRC-Entstehung spielt. Im Jahr 2013 wurde erstmalig gezeigt, dass die MGMT doch O6-CMG-Addukte reparieren kann, wobei dieser Versuch in einem zellfreien System durchgeführt wurde. Daher war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die Rolle der MGMT in der Reparatur des O6-CMG-Adduktes in einem Zellkulturmodell zu analysieren. Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen die frühere Annahme, dass die MGMT in der Lage ist das O6-CMG zu reparieren. MGMT-defiziente Zellen waren wesentlich empfindlicher auf das carboxymethylierende Agens Azaserin als die WT-Zellen. Die vorläufigen Daten der DNA-Adduktanalyse bestätigen, dass MGMT-defiziente Zellen nicht in der Lage sind diese Addukte zu reparieren. Die vorläufigen Daten weisen aber auch darauf hin, dass in den WT-Zellen noch teilweise O6-MeG- und O6-CMG-Addukte detektiert werden, sodass man davon ausgehen muss, dass die Effizienz, mit der die MGMT O6-CMG-Addukte repariert werden, geringer ist als im Fall von anderen Guaninaddukten. In früheren Arbeiten wurde bereits postuliert, dass auch die NER an der Reparatur von O6-CMG-Addukten beteiligt sein könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass vermutlich sowohl die NER als auch die MGMT in der Reparatur des O6-CMG-Adduktes involviert sind. NO-Häm als nitrosierendes Agens ist an der Bildung von Nitrosoverbindungen beteiligt und soll aufgrund der Ergebnisse früherer Studien eine wichtige Rolle in der CRC-Entstehung spielen. Die einmalige Inkubation der humanen Kolonepithelzellen (HCEC) mit NO-Häm zeigt, dass NO-Häm in die Zellen gelangt und dort zu nitrosativem Stress führt. Weiterhin wirkt es zyto- und genotoxisch. Eine mehrmalige Behandlung der Zellen führte jedoch nicht zu einer malignen Zelltransformation. Da jedoch weitere stark mutagen wirkende Substanzen nicht in der Lage waren, die HCEC-Zellen maligne zu transformieren, muss angenommen werden, dass diese Zellen aufgrund ihrer ausgeprägten genomischen Stabilität nicht als Zelltransformationsmodell geeignet sind. Aus diesem Grund wurde die potenziell zelltransformierende Wirkung von NO-Häm im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine mehrmalige Behandlung der Zellen mit 10 µM NO-Häm zu einer Transformation der Zellen führte. Dieser Befund unterstützt die Hypothese, dass NO-Häm an der Entstehung des CRCs beteiligt sein könnte. Nichtsdestotrotz muss bei der Analyse dieser Ergebnisse berücksichtigt werden, dass das NO-Häm nach dessen Synthese nicht extrahiert werden konnte und somit nicht in Reinform vorlag. Reaktionskomponenten und mögliche Nitritreste waren ebenfalls enthalten und könnten zu einem falsch-positiven Ergebnis beigetragen haben. Weiterführende Experimente mit hochgereinigtem NO-Häm und weiteren nicht-transformierten humanen Dickdarmepithelzelllinien sind nötig, um zu klären, ob NO-Häm tatsächlich an der malignen Transformation dieser Zellen beteiligt ist.
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