Optical imaging techniques for the study of cellular properties in developing neural systems

In dieser Arbeit wurden drei verschiedene optische Verfahren auf ihre Eignung für unterschiedliche Probleme in Entwicklungsstudien, wie z. B. unterschiedliche Probengrößen, die schnelle Beurteilung pharmakologischer Daten und die Manipulation ausgewählter Zellen, getestet. Die drei Teile dieser Arbeit beschäftigen sich mit diesen Problemen. Die Probendicke bestimmt die optische Technik, die für die Analyse des Präparates geeignet ist. Proben bis zu 100µm können durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden. Für Präparate von Submillimeterbereichen bis zu mehreren Millimetern ist die Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) verfügbar. Vor kurzem wurde eine Technik entwickelt, die für das Scannen größerer Proben geeignet ist, die Scanning Laser Optical Tomography (SLOT). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich SLOT für die Beurteilung von 3D-Daten von kleinen und mittelgroßen Proben eignet. Zusätzlich wurde evaluiert, ob SLOT für Manipulationsexperimente an sich entwickelnden neuralen Systemen verwendet werden kann. Das Bauchmark und Gehirne von Drosophila melanogaster L3-Larven wurden als kleine Probe verwendet. Mittelgroße Proben waren die Gehirne und optischen Loben von Locusta migratoria L1 und L3 Larven. Die Manipulation der zellulären Neurotransmitterspiegel erfolgte über die Injektion des Medikaments Reserpin in Heuschreckenlarven des dritten Larvenstadiums. Reserpin verhindert die Wiederaufnahme aminerger Neurotransmitter wie zum Beispiel des Serotonins in die synaptischen Vesikel. In allen Proben wurden Serotonin mittels Immunfluoreszenz visualisiert. Es wurde demonstriert, dass SLOT eine geeignete Methode ist, um 3d-Datensätze von Fluoreszenz- und Durchlichtsignalen der zu analysierenden Proben zu erhalten. Einzelne Zellkörper sowie die Neuriten der serotonergen Neuronen wurden deutlich dargestellt. Es konnte deutlich gezeigt werden, dass die Behandlung mit Reserpin dazu geführt hat, dass die Serotonin-Level in einigen, aber nicht allen serotonergen Neuronen, gesenkt wurde. Im zweiten Teil wurde ein Modell für die neuronale Differenzierung gewählt, um die cytosolische Calciumdynamik im Verlauf neuronaler Differenzierung zu analysieren: die humane embryonale Stammzelllinie NT2 (Klon D1). Diese Experimente wurden mit der Entwicklung einer schnellen Screening-Technik auf der Basis von Calcium-Imaging kombiniert. Mittels eines Calcium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs wurde die Reaktion von humanen NT2-Vorläuferzellen und Neuronen auf die Zugabe von Acetylcholin analysiert. Die nikotinischen Rezeptoren wurden durch d-Tubocurarin blockiert und die muskarinischen Rezeptoren durch Atropin. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass der cytosolische Calciumanstieg nach cholinerger Stimulation in NT2-Vorläuferzellen allein durch muskarinische Acetylcholin-Rezeptoren induziert wurde. Mittels Calcium-Imaging wurde eine Veränderung des cholinergen Rezeptortyps aufgrund der Retinsäure-induzierten Differenzierung nachgewiesen: Die NT2 Neuronen haben entweder muskarinische oder nikotinische Rezeptoren. Weiterhin wurde gezeigt, dass eine andauernde cholinerge Stimulation von NT2-Zellen während der neuronalen Entwicklung der Anteil an GABAergen Neuronen erhöht, während der Prozentsatz des cholinergen Phänotyps nicht verändert wird. Neben der Erfassung von zellulären Eigenschaften gibt es optische Techniken, die für die Manipulation von Proben angewendet werden können. Die optische Stimulation von Neuronen ist eine neuartige optische Technik, die im Fokus der aktuellen Forschung steht. In Zellen, die keine photosensitiven Pigmente exprimieren, kann die optische Anregung über Infrarotstimulation erfolgen. Diese optische Stimulation kann dadurch verbessert werden, dass die Zellen mit Nanopartikeln beladen werden. Elektrisch leitende Nanopartikel konzentrieren die Energie des Laserlichts durch einen physikalischen Prozess, der Plasmonresonanz genannt wird. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die NT2 Vorläuferzellen und Neurone mit Laserlicht mit und ohne Nanopartikel angeregt. Die Fluoreszenz des Calcium-Sensor Fluo-4 AM wurde verwendet, um die Effekte dieser optischen Stimulation zu analysieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die cytosolischen Calcium-Level in NT2 Zellen anstiegen, wenn die Zellen mit 532nm Laserpulsen angeregt werden. Wurden die Zellen mit 200nm Goldnanopartikeln behandelt, erfolgte in mehr Zellen eine Erhöhung der cytosolischen Calciumspiegel und der Anstieg des Calciumsignales war stärker. Darüber hinaus unterschied sich die Calciumantwort in NT2- Neuronen von den Calciumsignalen in NT2-Vorläuferzellen.