Induction of bronchus-associated lymphoid tissue by common zoonotic microorganisms, and establishment of a method for its quantification in whole lung lobes

Mzinza, David Twapokera

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Induction of bronchus-associated lymphoid tissue by common zoonotic microorganisms, and establishment of a method for its quantification in whole lung lobes

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Das bronchus-assoziierte lymphatische Gewebe (BALT) ist Teil eines ausgedehnten lymphatischen Netzwerks, welches das Atmungsepithel und andere Schleimhäute vor eindringenden Pathogenen schützt. Sowohl die Ursachen, die zur Entwicklung dieser Strukturen führen als auch ihre immunologischen Funktionen sind gegenwärtig nur unzureichend geklärt. Bei Wildtyp (WT) Mäusen kommt es normalerweise nicht vor, kann aber durch aerogene Infektion verschiedener respiratorischer Pathogene wie zum Beispiel Modifiziertes Virus Ankara (MVA), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Influenza und Pneumocystis jirovecii (P. jirovecii ) induziert werden 1–4. Die BALT-induzierenden Pathogene bestimmen hierbei welche Mechanismen und Zellpopulationen zur Entwicklung des BALT notwendig sind. In MVA-induziertem BALT differenzieren lokale Stromazellen zu CXCL13-produzierenden follikulären dendritischen Zellen (FDCs), welche B Zellen rekrutieren und die Bildung von B Zellfollikeln fördern. Während diese in P. aeruginosa-induziertem BALT fehlen, werden B Zellen hier durch ein anderes Chemokin, CXCL12, rekrutiert. Entscheidend für die Bildung und Aufrechterhaltung der B Zellfollikel in BALT induziert durch P. aeruginosa, Influenza und P. jirovecii BALT ist das Interleukin-17 (IL-17). Bei der Entwicklung von MVA-induziertem BALT spielt IL-17 hingegen keine Rolle. Diese Studien unterstreichen die Notwendigkeit BALT pathogen-spezifisch zu untersuchen, da sich durch die einzigartigen molekularen Eigenschaften jedes einzelnen Pathogens Unterschiede in den Entwicklungsmechanismen ergeben können. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit die Entwicklung von BALT durch unterschiedliche zoonotische Erreger, wie Escherichia coli (E. coli), Listeria monocytogenes und Streptococcus suis untersucht. Von den genannten Erregern führt nur die intranasale Verabreichung von E. coli zur Entwicklung von BALT mit organisierten B Zellfollikeln, die sowohl CXCL13-expremierende FDCs als auch andere Stromazellen, die CXCL12 produzieren beinhalten. Wird der CXCL13-CXCR5 Signalweg unterbunden, dominieren interessanterweise T Zellen das induzierte BALT, was auf eine entscheidende Rolle dieses Chemokin/Chemokinrezeptorpaars während der Rekrutierung von B Zellen und der Aufrechterhaltung der B Zellfollikeln hindeutet. Desweiteren wurde in dieser Arbeit ein Verfahren etabliert, welches die Analyse kompletter Lungenflügel und darin enthaltener lymphatischer Strukturen erlaubt. Die sogenannte Lightsheet-Mikroskopie (LiSM) ermöglicht nach entsprechender Antikörperfärbung und optischem Clearing der Probe die dreidimensionale Visualisierung des Bronchialsystems der Lunge sowie die Darstellung und Quantifizierung einzelner BALT Strukturen innerhalb kompletter Lungenflügel. Hierzu werden die Lungenflügel vor dem Imaging nach einem kürzlich beschrieben Protokoll (3DISCO: three-dimensional imaging of solvent-cleared organs; Ertürk et al., 2012) bis zur Transparenz geklärt, in einer mit Dibenzylether gefüllten Kammer mikroskopiert und anschließend mit einer Analysesoftware ausgewertet. In dieser Arbeit zeigt sich eindrucksvoll, dass sich dieses Verfahren sowohl zur Analyse der Organisation von spontanem und pathogen-induziertem BALT als auch zur Berechnung des gesamten BALT Volumens in WT und Knockout-Mäusen eignet und gleichzeitig Ergebnisse der konventionellen Immunhistologie bestätigt. Außerdem wurden erste Versuche zur spezifischen Färbung von lymphatischen Gefäßen in der Lunge mittels LiSM durchgeführt. Hierbei wurde Thy1/CD90 als geeigneter Marker identifiziert und erfolgreich zur dreidimensionalen Darstellung von Lymphgefäßen eingesetzt. Zusammenfassend stellt das hier entwickelte, neuartige Mikroskopie-Verfahren in Kombination mit konventionellen Mikroskopiemethoden eine exzellente Möglichkeit dar, die Entwicklung und Organisation lymphatischer Strukturen und Gefäße in der kompletten Lunge dreidimensional darzustellen und zu quantifizieren. In dieser Studie angewendet, konnte diese Technik bereits wesentliche Erkenntnisse zur E. coli-induzierten BALT Entwicklung liefern, welche für zukünftige Behandlungsstrategien gegen von E. coli hervorgerufene Infektionen von Bedeutung sein können.

Bronchus-associated lymphoid tissue (BALT) plays a key role in initiating and maintaining host protective immunity against invading pathogens. It is not constitutively found in most species but can be induced when the lung is exposed to different microorganisms or compounds that cause lung inflammation. Studies from our group describe the induction of BALT by modified vaccinia virus Ankara (MVA), and Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) in mice 1,2. BALT induced by MVA is characterized by the expression of C-X-C chemokine ligand 12 and 13 (CXCL12 and CXCL13); while in P. aeruginosa BALT only CXCL12 is present. In addition, influenza virus, and Pneumocystis jirovecii (P. jirovecii) have also been shown to induce BALT 3,4. Here, they attribute the formation of BALT through molecular mechanisms that are driven by T helper 17 (Th17) responses. From these results we learn that the development of microorganism-induced BALT is driven by different molecular mechanisms. Two pathways have been identified so far. Whereas one pathways rely on the presence of IL-17 (for example P. aeruginosa), the second is completely independent of IL-17 (for example MVA). To further understand the development and function of BALT, additional studies, that characterize its induction by other microorganisms, are needed. So far, BALT is primarily investigated by immunohistology but this approach might not reflect the composition of BALT in the entire lung since only a limited number of sections can be analyzed. Additional approaches to study BALT in the entire lung are urgently needed. Therefore, I set out to develop a method that allows analysis of BALT in the entire lung. During my doctoral studies, I investigated the induction of BALT by Escherichia coli (E. coli), Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and Streptococcus suis (S. suis). These microorganisms were heat inactivated, before being administered into mice intranasally. Formation of BALT was assessed by histological examination of lung cryosections stained by lymphocyte-specific antibodies. Out of the three microorganisms above, only E. coli could induce BALT which is characterized by the presence of organized B cell follicles accompanied by T cells, follicular dendritic cells (FDCs) expressing CXCL13 as well as other CXCL12-expressing stromal cells. This presentation of BALT by E. coli, regarding chemokine expression, is like results from MVA-induction model, but different from P. aeruginosa, as described above. I also established the application of light sheet microscopy (LiSM) for the analysis of BALT in whole lung lobes. BALT within lobes was identified by antibody-staining of its constituent T and B cell aggregates. Prior to imaging, lobes were optically cleared in order to match the refractive index (RI) of the lobes with that of the imaging solvent, Dibenzyl ether (DBE). I achieved this by using a protocol that was previously described by Ertürk et al. in 2012, called three-dimensional imaging of solvent-cleared organs (3DISCO) which can be used to clear different specimens. Thereafter, cleared lung lobes were imaged by LiSM and BALT was analyzed by Imaris software. Using this approach, I could nicely show the lung’s bronchial tree, the organization and volume of BALT as well as lymphocyte distribution within the entire lobes from uninfected or BALT-bearing mice. Interestingly, when using mice lacking the chemokine receptor CXCR5 E. coli-induced BALT is dominated by T cell aggregates. Furthermore, I performed LiSM to visualize the lymphatics distribution within lung lobes using Thy1/CD90 as a suitable marker for murine lung lymph vessels. This is the first study that describes the induction of BALT by a single intranasal dose of E. coli and identifies chemokines and chemokine receptors involved in this process. These results help to understand E. coli-specific immune responses and might contribute to the development of further strategies to control its associated infections. Moreover, the application of LiSM on whole lung lobes provides essential new insights in lung architecture as well as in understanding the development and organization of lymphoid aggregates within the whole lung, under different conditions.