Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Interaction of intestinal food-borne bacterial pathogens with Toll-like receptor 5

Faber, Eugenia

Pattern recognition receptors (PRR), including Toll-like receptors (TLR), play a key role at the first line of defense by the innate immune system of a vertebrate host against pathogenic invaders. TLR5 is the PRR for bacterial flagellin and contributes to shaping the intestinal microbiota composition and immune homeostasis in the gut. Some gastrointestinal bacterial pathogens, among them Campylobacter and Helicobacter species, evolved escape mechanisms in order to avoid TLR5 recognition, and their classical flagellins FlaA and FlaB show very low activating capacity on TLR5. In addition, numerous intestinal unsheathed Campylobacter and closely related species possess a further secreted flagellin-like protein FlaC. No direct functionality of FlaC was assigned in previous studies. Our first project in this thesis aimed to characterize the function of the unusual flagellin-like protein FlaC in more detail. Analysis in cell culture suggested an interaction of FlaC with human and chicken TLR5. Moreover, cell coincubation experiments demonstrated that FlaC triggered a rather partial cellular activation in comparison to the canonical TLR5 ligand, Salmonella flagellin FliC. We propose that the observed unusual signaling pattern of FlaC was most likely connected to its chimeric amino acid assembly, consisting of TLR5-activating as well as non-activating residues. FlaC activity became most evident in the presence of other immune-stimulating factors. FlaC and FlaC-expressing bacteria led to cell tolerization and reduced cellular responsiveness towards other MAMPs (microbe-associated molecular patterns) in time-shifted or parallel cell coincubation experiments. Application of purified FlaC in Campylobacter’s natural host, the chicken, revealed that FlaC alone was sufficient to dampen local immune responses in vivo and to modulate the avian caecal microbiota composition. Based on these findings, we conclude that FlaC might play a role during host colonization by Campylobacter in the context of resident microbiota and support chronic bacterial persistence by its homeostatic manner of action. It remains unknown whether functional differences of FlaC exist in various vertebrate hosts. This question should be clarified in future research, since its answer might contribute to the understanding of the differential, and still not understood, host species-specific and individually variable outcome of Campylobacter infections. In this context, host species-specific alterations regarding anti-microbial immune responses and innate receptor variation might also play a role. Therefore, our second manuscript focused on a comparative investigation of TLR5 functionality of diverse vertebrate species. The expression and subsequent activation of human, chicken, murine, porcine and bovine TLR5 by the canonical TLR5 ligand Salmonella flagellin (FliC) revealed signaling restrictions of the chicken or porcine receptors within human cells. Since we hypothesized that incompatibility with the heterologous expression background is responsible for the observed handicaps in TLR5 signaling, we designed and generated chimeric receptors. These TLR5 chimeras consist of a common human transmembrane and intracellular receptor part, linked to respective heterologous (chicken, murine, porcine and bovine) extracellular domains (ECD). All chimeric receptors were expressed successfully in human cells. Moreover, the functionality of all chimeras was confirmed on the level of NF-κB, p38 phosphorylation, IRAK-1 degradation and secretion of IL-8. Use of TLR5 chimeras allowed establishment of a cell-based system for the comparative investigation of host species-specific differences in TLR5 activation by the important human zoonotic pathogens Campylobacter jejuni and Salmonella enterica. While whole bacterial lysates and flagellins of numerous C. jejuni isolates activated the tested TLR5 chimeras only to a minor extent, lysates of various Salmonella serovars evoked a stronger, serovar- and host species-specific, ECD-dependent TLR5 activation. Host species-specific differences in TLR5 stimulation were rather not detectable for the corresponding Salmonella flagellins, which all activated strongly in preliminary experiments. This suggests that diverse Salmonella strains possess additional factors for the modulation of TLR5 responses in a serovar- and host species-specific fashion. In summary, this work contributed to the understanding of TLR5 function and host-pathogen interactions of the important human pathogen C. jejuni by the discovery of new functions of its unusual flagellin-like protein FlaC, which is also present in numerous closely related bacterial species. The study also revealed novel host-interaction modes of S. enterica strains with respect to TLR5. On the host side, comparative analysis of TLR5 from diverse vertebrate species identified cross-species functionality barriers. Furthermore, our established cell-based system using TLR5 chimeras was verified as a useful tool for the characterization of host species-specific activation differences by diverse bacteria and their flagellins.

Mustererkennungsrezeptoren (Pattern Recognition Receptors, PRR), darunter Toll-like Rezeptoren (TLR), spielen eine zentrale Rolle bei der primären Verteidigung des angeborenen Immunsystems eines vertebraten Wirtes vor pathogenen Eindringlingen. TLR5 ist der für bakterielles Flagellin zuständige PRR und darüber hinaus an der Ausprägung der intestinalen mikrobiellen Zusammensetzung und der Immunhomöostase im Darm beteiligt. Einige gastrointestinale bakterielle Pathogene, wie z. B. einige Campylobacter und Helicobacter Spezies, entwickelten immunologische Evasionsmechanismen, um die Erkennung durch TLR5 zu vermeiden, und ihre klassischen Flagelline FlaA und FlaB weisen ein sehr geringes Aktivierungspotential von TLR5 auf. Außerdem verfügen zahlreiche intestinale Campylobacter ohne Flagellenhüllen und weitere eng verwandte Spezies über ein zusätzliches, sezerniertes Flagellin-ähnliches Protein FlaC. FlaC konnte keine direkte Funktion in vorherigen Studien zugeordnet werden. Unser erstes Projekt dieser Arbeit verfolgte das Ziel, die Funktion des ungewöhnlichen Flagellin-ähnlichen Proteins FlaC detaillierter zu charakterisieren. Zellkultur-basierte Untersuchungen wiesen auf eine Interaktion von FlaC mit menschlichem und Hühner-TLR5 hin. Des Weiteren wurde in Zellinkubationsexperimenten gezeigt, dass FlaC im Vergleich zu dem kanonischen TLR5 Liganden Salmonella Flagellin (FliC) eine eher partielle zelluläre Aktivierung auslöste. Wir schlagen daher vor, dass die ungewöhnliche Art der Signalisierung von FlaC höchst wahrscheinlich mit seinem chimären Aminosäureaufbau zusammenhängt, der sowohl aus TLR5-aktivierenden als auch nicht-aktivierenden Aminosäureresten besteht. Die Wirkweise von FlaC zeigte sich am deutlichsten in Anwesenheit von anderen immunstimulierenden Faktoren. FlaC und FlaC-exprimierende Bakterien führten zur zellulären Toleranz und reduzierten die zelluläre Reaktionsfähigkeit gegenüber anderen MAMPs (Microbe-Associated Molecular Patterns) in zeitversetzten und parallelen experimentellen Koinkubationen in Zellkultur. Eine Verabreichung von gereinigtem FlaC im natürlichen Wirt von Campylobacter, dem Huhn, zeigte, dass FlaC allein ausreichte, um lokale Immunantworten in vivo zu senken und die aviäre, zäkale Zusammensetzung der Mikrobiota zu modulieren. Basierend auf diesen Erkenntnissen kommen wir zu dem Schluss, dass FlaC zur Wirtskolonisierung von Campylobacter im Kontext der wirtseigenen Mikrobiota beitragen und die chronische bakterielle Persistenz mit Hilfe seiner homöostatischen Wirkweise unterstützen könnte. Derzeit ist noch unklar, ob funktionelle Unterschiede von FlaC in verschiedenen vertebraten Spezies existieren. Die Beantwortung dieser Fragestellung bedarf weiterer Forschung und könnte zum Verständnis von Wirtsspezies-spezifischen und individuell variablen Krankheitsverläufen von Campylobacter-Infektionen beitragen. In diesem Kontext könnten Wirtsspezies-spezifische Unterschiede hinsichtlich anti-mikrobieller Immunantworten sowie Variationen von Rezeptoren des angeborenen Immunsystems eine Rolle spielen. Daher fokussierte sich unser zweites Manuskript auf eine vergleichende Analyse der Funktionalität von TLR5 verschiedener vertebrater Spezies. Die Expression und anschließende Aktivierung von humanem, Hühner-, Maus-, Schweine- und Rinder-TLR5 durch den kanonischen Liganden Salmonella Flagellin (FliC) zeigten Beeinträchtigungen innerhalb der Signalweiterleitung von Hühner- und Schweine-Rezeptoren in humanen Zellen. Da unserer Hypothese nach Inkompatibilitäten mit dem heterologen Expressionssystem für die beobachteten Behinderungen der TLR5-Signalweiterleitung verantwortlich waren, entwarfen und generierten wir chimäre Rezeptoren. Diese TLR5-Chimären bestehen aus einem einheitlichen humanen transmembranen und intrazellulären Rezeptoranteil, der an heterologe (Hühner-, Maus-, Schweine- oder Rinder-) extrazelluläre Domänen (ECD) gekoppelt ist. Alle chimären Rezeptoren wurden erfolgreich in humanen Zellen exprimiert. Darüber hinaus wurde die Funktionalität aller Chimären auf der Ebene von NF-κB, p38 Phosphorylierung, IRAK-1 Abbau und IL-8 Sekretion bestätigt. Die Nutzung von TLR5-Chimären ermöglichte die Etablierung eines zellbasierten Systems, um Wirtsspezies-spezifische Unterschiede hinsichtlich der TLR5-Aktivierung durch die wichtigen menschlichen, zoonotischen Pathogene Campylobacter jejuni und Salmonella enterica vergleichend zu untersuchen. Während die bakteriellen Lysate und Flagelline von zahlreichen C. jejuni-Isolaten die getesteten TLR5-Chimären lediglich in geringem Maße aktivierten, riefen Lysate verschiedenster Salmonella-Serovare eine stärkere, Serovar- und Wirtsspezies-spezifische, ECD-abhängige TLR5-Aktivierung hervor. Wirtsspezies-spezifische Unterschiede in der TLR5-Stimulierung konnten für entsprechende Salmonella-Flagelline, die alle stark aktivierten, in vorläufigen Experimenten nicht detektiert werden. Dies deutet darauf hin, dass diverse Salmonella-Stämme zusätzliche Faktoren aufzuweisen scheinen, die in der Lage sind, TLR5-Aktivierungen auf eine Serovar- und Wirtsspezies-spezifische Art zu modulieren. Insgesamt hat diese Arbeit zum Verständnis der Funktionalität von TLR5 und von Wirts-Pathogen-Interaktionen des bedeutenden humanen Pathogens C. jejuni beigetragen, indem sie neuartige Funktionen des ungewöhnlichen Flagellin-ähnlichen Proteins FlaC, welches auch in zahlreichen eng verwandten Spezies vorhanden ist, aufdeckte. Diese Arbeit zeigt auch neuartige Arten von Wirtsinteraktionen von S. enterica-Stämmen in Bezug auf TLR5 auf. Auf Wirtsebene konnten vergleichende Analysen von TLR5 verschiedener vertebrater Spezies artübergreifende Funktionalitätsdefekte identifizieren. Darüber hinaus konnte unser etabliertes zellbasiertes System unter Einsatz von TLR5-Chimären als nützliches Werkzeug verifiziert werden, um Wirtsspezies-spezifische Aktivierungsunterschiede diverser Bakterien und ihrer Flagelline zu charakterisieren.

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Faber, Eugenia: Interaction of intestinal food-borne bacterial pathogens with Toll-like receptor 5. Hannover 2017. Tierärztliche Hochschule.

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