The Libechov minipig as a transgenic animal model for preclinical research in Huntington’s disease – Results of an observational study comparing motor, cognitive, behavioral and metabolic endpoints

Schuldenzucker, Verena

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The Libechov minipig as a transgenic animal model for preclinical research in Huntington’s disease – Results of an observational study comparing motor, cognitive, behavioral and metabolic endpoints

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Die Huntington’sche Krankheit (Huntington disease, HD) ist eine autosomale, neurodegenerative, progressive Krankheit. Die genetische Lokalisation von HD befindet sich auf dem kurzen Arm von Chromosom 4 und manifestiert sich in einer erhöhten Anzahl an CAG Triplett-Wiederholungen (Polyglutaminerkrankung). Bis heute spricht man von einer normalen Triplett-Anzahl bis 35 Wiederholungen. Mit einer Anzahl von 36 oder mehr Tripletts wird man als (wahrscheinlich) betroffen klassifiziert und hat ein Risiko von 50%, das betroffene Gen an die Nachkommen zu vererben. Der Beginn der Krankheit (zwischen 35 und 44 Jahren) sowie das Fortschreiten und der Schweregrad der Symptome korrelieren mit der Anzahl der CAG Tripletts. Nach stetiger Zunahme des Schweregrades der Symptome, sterben die Patienten ca. 15-20 Jahre nach Ausbruch der Krankheit. Die Symptome der HD äußern sich in einem verminderten Gehirn-Volumen (prämanifest), besonders im Bereich des Striatums, kognitiven Defiziten, motorischen Störungen, psychischen Veränderungen und Kachexie. Es wurde bereits sehr viel Forschung im Bereich der HD getätigt, angefangen mit Toxin-Modellen (vor der Entschlüsselung des HD Gens) und gefolgt von vielen erfolgreichen Tiermodellen. Um eine geeignete Schnittstelle zwischen präklinischer Forschung und Patienten zu bilden, sind Großtiermodelle in der Forschung unumgänglich. Aus diesem Grund wurde vor über drei Jahren die Langzeit-Pilotstudie mit transgenen Minipigs der Huntington’schen Krankheit (tgHD=14) sowie Wildtyp-Kontrollen (wt=18) gestartet. Das Ziel der Studie war es, zu untersuchen, ob Schweine generell dazu fähig sind, an einer neu etablierten Testbatterie über mehrere Jahre hinweg zuverlässig teilzunehmen und ob diese Testbatterie dabei helfen kann, einen Phänotyp in den transgenen Minipigs zu detektieren. Die Umsetzung der Testbatterie basiert auf der Unified Huntington’s Disease Rating Scale (UHDRS) für humane Patienten. Sie besteht aus einem motorischen (Zungen- und Hürden-Test), einem kognitiven (Farb-Diskriminierungs-Test) sowie einem verhaltensorientierten (Dominanz-Test) Teil. Als Hauptparameter wurde die Zeit [s] gemessen, die die Schweine benötigen, um die einzelnen Abschnitte der jeweiligen Tests durchzuführen. Des Weiteren wurde die Anzahl der gefressenen Cornflakes (Zungen-Test) sowie die Anzahl der Versuche eine falsche Box im Diskriminierungs-Test zu öffnen notiert und ausgewertet. Ein weiterer, neu entwickelter Test zur Erfassung eines Biomarkers (Cortisol) war der Stress-Test. Hierbei wurde der Anstieg des Stresshormons Cortisol nach einem spezifischen Stressor (Klauenpflege) ausgewertet. Alle Parameter wurden mit RStudio analysiert und auf Unterschiede zwischen den Genotypen untersucht. Die hier präsentierte Studie zeigt, dass die Arbeit mit Minipigs praktikabel ist und dass die Tiere ohne Ausnahme an allen Tests teilgenommen haben. Die Schweine benötigen keine lange Akklimatisierung-Phase und sogar der spontan neu entwickelte Cortisol Stress-Test konnte schnell und einfach umgesetzt und durchgeführt werden. Dies öffnet die Tür für weitere Untersuchungen sowie die Fortführung der Testbatterie. Ein weiterer erwähnenswerter Punkt ist zudem die Etablierung einer funktionierenden Testbatterie für Großtiermodelle, welche eine kontinuierliche und zuverlässige Arbeit mit den Tieren zulässt. Neben dem Ziel der Phänotypisierung wurden einige weitere interessante Ergebnisse erzielt. Zum einen wurde ein Lerneffekt im kognitiven Bereich entdeckt, zum anderen konnte der typische Cortisol-Anstieg nach einem Stressor in den Minipigs bestätigt werden. Im Großen und Ganzen ist es denkbar, dass all diese neu gewonnenen Erkenntnisse auch auf andere Großtiermodelle, wie z.B. Schaf- oder Affenmodelle, angepasst werden können. Dass zum heutigen Zeitpunkt noch kein Phänotyp der Huntington’schen Krankheit detektiert werden konnte, liegt eventuell an dem langsam fortschreitenden Charakter der Krankheit. Sollte sich die Krankheit im Schweinemodell erst im Laufe der nächsten Jahre äußern, spricht dies wiederum für eine sehr gute Vergleichbarkeit mit der Krankheit im Menschen. All diese Erfahrungen der letzten Jahre sind erfolgsversprechend, die Lücke zwischen präklinischer Forschung und Patientenstudien zu schließen.

Huntington’s disease (HD) is an autosomal, neurodegenerative, progressive disorder. The genetic disorder is located on the short arm of chromosome 4 and manifests itself in an increased number of CAG repeats (polyglutamine disease). To date, classifications describe a normal CAG repeat count up until 35 repeats. Thirty-six and more repeats are classified as (possibly) bearing a 50% risk of their offspring inheriting the affected gene. Onset (between 35 and 44 years), progression and severity of the disease is correlated with the number of CAG repeats. After suffering from increasing symptoms, death occurs 15-20 years after disease onset. Symptoms manifest themselves in a reduced brain volume (premanifest), especially evident in the striatum, cognitive deficits, motor dysfunctions, psychiatric changes and cachexia. There has been done a lot of research carried out in the field of HD, starting with toxin models before the HD gene was decoded, followed by several successful animal models. In order to find the closest link between preclinical research and human patients, the work with LA models is indispensable. For this reason, a long-term observational pilot study in tgHD minipigs (n=14) and wildtype controls (n=18) was started more than three years ago. The aim of this study was to investigate whether a transgenic pig model of HD will participate in a newly developed test battery and if this battery can help to detect a disease phenotype in these animals. The implementation of the battery was based on the Unified Huntington’s Disease Rating Scale (UHDRS) for human patients and consisted of a motoric (tongue and hurdle test), cognitive (discrimination test) and behavioral (dominance test) part. The main parameter measured during the tests was the time [s] needed to conduct different sections of the particular test. Furthermore, the number of treats collected (tongue test) and the number of attempts to open a wrong box (discrimination test) were recorded. Another setup invented to collect a wet biomarker (cortisol) was the stress test. Any increase in the stress hormone after a specific stressor (hoof trimming) was recorded. All of the parameters were analyzed and compared between the genotypes using RStudio. he results of the presented study showed no differences between the genotypes. Nevertheless, they confirmed that the study with minipigs is feasible as they participated in the behavioral and stress tests without exception. The animals did not need a long period of time to get acclimatized to the experimenter or to the setup. Newly developed tests, like the cortisol stress test in this case, could be executed fast and easily. This paves the way for more investigations and the continuation of the presented test battery. All in all, a well-functioning test battery, which allows continuous and reliable work with LA models, was established. Moreover, aside from the phenotype investigations, many interesting findings can be reported. Some learning effects regarding the cognitive task were discovered and it could be confirmed that minipigs show a similar cortisol rise after a stressor as humans do. Overall, it is conceivable that all these newly collected data can be adapted to other LA models like sheep and monkeys. The fact that there is no phenotype detectable so far might be due to the slowly progressing character of HD. If a phenotype manifests during the next years, this would vouch for a good comparability to disease progression in humans. All our investigations made over the last years are promising, helping to close the gap between preclinical research and patient studies.