Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

In vitro Verdauungsstudien im RUSITEC mit Pansensaft vom Rind zum Vorkommen von phenolhaltigen Substanzen aus Grassilagen sowie deren Bindungsverhalten mit Eiweißen

Hunsche, Corinne

Background of this thesis is the occurrence of unspecific clinical symptoms (decreased milk yield, decreased fertility, digestive disorders) in dairy cattle herds in the North of Germany, described as “Faktorenerkrankung Milchviehherde” (“factorial diseases in dairy herds”).   The feeding of grass silages without any sensory deficiency, but containing less than 50 % true protein in total crude protein (TP/CP) constitutes a potential cause due to the apoptosis in these silages. Feeding these silages may lead to a change in the ruminal microbiome.   The aim of this study was to analyze effects of these silages (< 50 % TP/CP) and soy protein on phenolic substances (at two places of in vitro digestion) and volatile fatty acids.   The RUSITEC was used during twelve digestive experiments pooled into three run blocks (L31-34, L35-38, L39-42) to ferment control silage (> 50 % TP/CP) and starch (KF), grass silage (< 50 % TP/CP) and starch (TF), and grass silage (< 50 % TP/CP) and starch and soy protein (TFmS). The 28 days of one digestive experiment were divided into three stages: The initial and stable phase (eight days, with control silage being fed), the trial phase (ten days, with control silage and grass silage < 50 %TP/CP as well as soy protein being fed) and the final stage (ten days, with control silage being fed).   Production of volatile fatty acids was detected via gas chromatography. The method of HOLLOWAY et al. (1979) modified by GÖRES (2016) was used to analyze the total contents of phenolic substances. Contents of o-diphenols were measured using the methods of ARNOW (1937) and FRAISSE et al. (2011), modified by GÖRES (2016). Furthermore, pepsin hydrochloric acid solution was added to samples of the supernatant to simulate conditions of the abomasum.   Feeding grass silage (< 50 % TP/CP) caused a minor increase in production of acetic acid during L39-42 (TF: +8.31 %, with added soy protein TFmS: +5.61 %, compared with control) as well as a high increase in productions of n valerate (TF: +77.8 %, TFmS: +93.3 %) and capronate (TF: +82.8 %, TfmS: +77.9 %). These results correspond to the results of L31-38 (GÖRES 2016). Production of propionate was moderately increased (TF: +28.5 %, TFmS: +30.1 %) and production of n butyrate increased slightly (TF: +14.1 %, TFmS: +11.9 %), similar to the contents of total phenolic substances (TF: +7.28 %, TFmS: +7.97 %).   The results of L31-38 imply the existence of two different patterns of fermentation in the rumen, whereas results of L39-42 can be positioned centrally in relation to L31-38, with a tendency to L31-34, while not revealing a new fermentation pattern.   Soy protein did neither affect production of volatile fatty acids nor content of phenolic substances.   The content of total phenolic substances and o-diphenolics in the supernatant (L35-42) increased considerably when only grass silage (< 50 % TP/CP) and starch were fed. When soy protein was added, there were no distinct effects on the contents of phenolic substances.   Feeding grass silage (< 50 % TP/CP) with possibly phenolic substances to be bound in complexes, leading to them being undegradable in the rumen but not in the abomasum. This can account for the higher measured contents of phenolic substances in the supernatant.   In contrast to this, added soy protein potentially caused these phenolic complexes to be either completely degradable in the rumen or not degradable at all, thus evading measurement under abomasum-like conditions, and being excreted.   The increase of phenolic substances in the abomasum could be a cause for the unspecific clinical symptoms in dairy cattle herds.

Hintergrund der hier vorliegenden Arbeit ist ein auf norddeutschen Milchviehbetrieben aufgetretenes Krankheitsgeschehen (Rückgang der Futteraufnahme, Absinken der Milchleistung, Verdauungs- und Reproduktionsstörungen, mangelnde Klauengesundheit etc.), beschrieben als „Faktorenerkrankung Milchviehherde“. Die Ursache der unspezifischen Erkrankung wird auf die Verfütterung von Grassilagen, die sensorisch eine gute bis sehr gute Qualität aufweisen, jedoch einen zu niedrigen Reineiweißanteil (RE) am Rohprotein (RP; < 50 %) enthalten, zurückgeführt. In diesen, als Schadsilagen deklarierten Futtermitteln, findet die Apoptose statt, d.h., der Faseraufschluss ist bereits fortgeschritten und Proteine gelangen als kleinere Fragmente in den Pansen. Dies kann zu erheblichen Veränderungen im Fermentationsmuster des ruminalen Mikrobioms führen, sodass bestimmte Substanzen möglicherweise verändert oder unvollständig abgebaut werden und somit einen Anteil am Krankheitsgeschehen haben.   Ziel dieser Arbeit war, Auswirkungen der Schadsilagen auf den Gehalt an phenolischen Substanzen (an zwei unterschiedlichen in vitro Entnahmeorten) und flüchtigen Fettsäuren sowie einen Einfluss einer Aufwertung des Reineiweißgehaltes mittels Sojaprotein zu analysieren.   Zur Probengewinnung wurde das RUSITEC-System genutzt. Im künstlichen Pansen wurden im Gesamtprojekt in zwölf Versuchsdurchgängen (Läufe) Grassilagen, Schadsilagen (< 50 % RE/RP, 1. Schnitt 2014, 1. Schnitt 2015) und Kontrollsilagen (> 50 % RE/RP, 3. Schnitt 2014), von Flächen von zwei Betrieben, getestet. Die Läufe (L) wurden in drei Gruppen eingeteilt, bezeichnet nach einem fortlaufenden System (L31-34, L35-38, L39-42). Ein Durchgang erstreckte sich über 28 Tage, die sich in Einlauf- und Kontrollphase (bis Tag 8), Zulagephase (Tag 9-19) sowie Erholungs-phase (Tag 20-28) unterteilten. Die Kontrollfermenter (KF) wurden kontinuierlich mit Kontrollsilage und Stärke gefüttert, während der Zulagephase wurden in den Testfermentern Schadsilage und Stärke (TF) sowie Schadsilage, Stärke und Sojaprotein (TF-mS) zugelegt.   Die Produktion der flüchtigen Fettsäuren wurden mittels einem Zweikanalgaschromatographen bestimmt. Zur kolorimetrischen Messung des Gehalts an freien phenolischen Substanzen wurden die Methoden von HOLLOWAY et al. (1979), modifiziert von GÖRES (2016) zur Messung des Gesamtphenolgehalt, sowie von ARNOW (1937) und FRAISSE et al. (2011), modifiziert von GÖRES (2016) zur Bestimmung des o-Diphenolgehalts, genutzt. Die Proben der Überstandsflüssigkeit („Labmagen“-Bedingungen) wurden mit Pepsin-HCL-Lösung versetzt.   Die Zulage der Schadsilagen führte in L39-42 zu geringen Veränderungen der Essigsäureproduktion (TF: +8,31 %, TFmS: +5,61 %), hochgradigem Anstieg der n-Valeriansäure (TF: +77,8 %, TFmS: +93,3 %) und Hexansäure (TF: +82,8 %, TfmS: +77,9 %). Diese Ergebnisse entsprachen den vorangegangenen Versuchen (L31-38, GÖRES 2016).   Die Propionsäureproduktion war mittelgradig erhöht (TF 35: +28,5 %, TF 35mS: +30,1 %) bei geringgradig erhöhter n Buttersäureproduktion (TF 35: +14,1 %, TF 35mS: +11,9 %) und geringgradig erhöhtem Gesamtphenolgehalt (TF 35: +7,28 %, TF 35mS: +7,97 %). Bei der Propion- und n-Buttersäureproduktion sowie dem Gehalt an phenolischen Substanzen im Fermenter kam es im Gesamtprojekt zu einer unterschiedlich gerichteten Beeinflussung des Fermentationsmusters. Diese Ergebnisse von L31-38 (GÖRES 2016) lassen auf das Vorliegen von zwei Fermentationsmustern schließen, bei dem die Ergebnisse von L39-42 mittig, mit einer Tendenz zu den Ergebnissen von L31-34, zwischen L31-38 eingeordnet werden können, ohne dass ein neues Fermenationsmuster vorliegt. Das Sojaprotein hatte keinen Einfluss auf die Produktion der flüchtigen Fettsäuren sowie den Gehalt an phenolischen Substanzen im Fermenter.   Unter „Labmagen“-Bedingungen kam es nach reiner Schadsilagezulage zu einem massiven Anstieg der phenolischen Substanzen (in L35-42), mit Sojaproteinzulage hingegen stiegen die Werte kaum.   Die möglicherweise nach reiner Schadsilagefütterung überwiegend in Komplexen gebundenen phenolischen Substanzen können erst im Labmagen abgebaut werden, sodass es hier zu einem massiven Anstieg an freien Substanzen kommen könnte. Mit Sojaproteinzulage können diese Komplexe hingegen entweder im Pansen vollständig eliminiert werden oder überhaupt nicht aufgeschlossen werden, sodass sie sich der Messung unter labmagenähnlichen Verhältnissen entziehen und ausgeschieden werden könnten.   Der Anstieg an phenolischen Substanzen im Labmagen ist möglicherweise eine Ursache des Krankheitsgeschehens.

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Hunsche, Corinne: In vitro Verdauungsstudien im RUSITEC mit Pansensaft vom Rind zum Vorkommen von phenolhaltigen Substanzen aus Grassilagen sowie deren Bindungsverhalten mit Eiweißen. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule.

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