Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Early pathogenesis of classical bovine spongiform encephalopathy in young calves

Ackermann, Ivett

Classical bovine spongiform encephalopathy (C-BSE) is a fatal neurodegenerative disease in cattle. It belongs to the group of transmissible spongiform encephalopathies, or prion disease, which are caused by the conversion of the host-encoded cellular prion protein (PrPC) to its pathological isoform PrPTSE. After oral exposure to C-BSE, the ileal Peyer’s patch (IPP) represents the entry port for the BSE agent. Then, the agent spreads centripetally from the gut to the central nervous system (CNS), utilizing primarily the autonomic nervous system. However, the timeline of this infection progression has remained widely undetermined so far, as previous studies focused on later time points after oral challenge of cattle at 4 to 6 months of age. There are strong indications that young animals have a higher risk of infection.   The aim of the present study was to determine the earliest time point at which newly formed PrPBSE and BSE infectivity are detectable in the IPP and in the nervous system of cattle. Furthermore, this study aimed to evaluate the potential of the Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) as an in-vitro alternative method to mouse bioassays for the highly sensitive detection of BSE prions. For this, 20 unweaned calves were orally challenged with C-BSE and euthanised 1 week as well as 2, 4, 6 and 8 months post infection (mpi). The IPP as well as peripheral and central nervous tissues were examined for BSE infectivity by Tgbov XV mouse bioassay and for PrPBSE by immunohistochemistry (IHC) and PMCA.    During the course of this study, the analytical sensitivities of these methods used were assessed. The transgenic Tgbov XV mouse bioassay and a PMCA protocol with 4 amplification rounds both detected BSE prions up to a 10-8.3 dilution of the brainstem homogenate used for challenge of the calves. The comparable sensitivities of PMCA and Tgbov XV mouse bioassay may allow the partial replacement and thereby reduction as well as refinement of bioassays aiming to prove the presence or absence of the BSE agent in bovine samples, which is relevant for future BSE pathogenesis studies. Thus, the PMCA was shown to be an optimal method for analysing tissues with even low titres of BSE prions. This finding proved that the assays chosen here are highly sensitive methods that are appropriate for tracking small amounts of the C-BSE agent in bovine tissues.   This study showed the presence of the BSE agent in the ileum of cattle earlier than hitherto reported. BSE prions were detected in the IPP as early as 2 mpi by Tgbov XV mouse bioas-say and PMCA as well as from 4 mpi by IHC in follicular dendritic cells of the IPP follicles. From 4 mpi, high infectivity titres and ++ to +++ positive PMCA amplification reactions were revealed for the IPPs of most calves. These new data indicated that a facilitated BSE prion uptake combined with an age-dependent reduction of clearance efforts may have triggered the prion replication at such early time points after oral infection.   The here reported analyses refuted the hypothesis that nervous tissues of cattle are most probably free of PrPBSE and BSE prion infectivity during the early phase after oral BSE infection. By IHC, PrPBSE granules were seen in a submucosal plexus of the enteric nervous system of one calf at 2 mpi. Mouse bioassay and PMCA detected BSE prions in the nodal ganglion and the thoracic spinal cord of one calf at 8 mpi. These novel findings indicated that the centripetal prion spread is initiated almost immediately after oral BSE challenge. Subsequently, this study performed comparative PMCA analyses of thoracic spinal cord samples from cattle challenged at 4 to 6 months of age during an earlier pathogenesis study. Thereby, PrPBSE amplification at 8 mpi in the thoracic spinal cord of older cattle confirmed the observation of early centripetal spread and suggested that the speed of neuroinvasion in cattle does not vary with age.   In conclusion, these new data confirmed the IPP as the entry port for the BSE agent and a location of initial prion propagation almost immediately after oral infection. Although the prion uptake seemed to be increased in the intestine of unweaned calves, this study did not observe any hints for age-dependent differences in the neuroinvasion or further progression of the C-BSE infection. The obtained data might be useful for risk assessment regarding consumer and public health protection measures. Moreover, the highly sensitive PMCA protocol allows reduction of mouse bioassays in future BSE pathogenesis studies.

Die klassische Bovine Spongiforme Enzephalopathie (C-BSE) ist eine tödlich verlaufende neurodegenerative Erkrankung bei Rindern, welche zur Gruppe der Transmissiblen Spon-giformen Enzephalopathien, auch Prionen-Erkrankungen genannt, gehört. Die Entstehung dieser Erkrankungen basiert auf der Konversion des körpereigenen zellulären Prion-Proteins (PrPC) in seine pathologische Isoform PrPTSE. Nach oraler Exposition mit C-BSE stellt die ileale Peyer’sche Platte (IPP) die Eingangspforte für das BSE-Agens dar. Danach breitet sich der Erreger zentripetal vom Darm, vorwiegend über das autonome Nervensystem, in Richtung des zentralen Nervensystems (ZNS) aus. Allerdings blieb der genaue zeitliche Verlauf dieses Infektionsfortschritts bisher überwiegend unbestimmt, da sich bisherige Studien auf spätere Zeitpunkte nach der oralen Infektion von 4 bis 6 Monate alten Rindern konzentrierten. Es gibt aber durchaus Hinweise darauf, dass Jungtiere empfänglicher für BSE sind.   Ziel dieser Studie war es, den frühestmöglichen Zeitpunkt zu bestimmen, zu dem neuentstandene BSE-Infektiosität und PrPBSE in der IPP und dem Nervensystem von Rindern detektierbar sind. Zudem wurde in dieser Studie angestrebt, die Protein Misfolding Cyclic Ampli-fication (PMCA) hinsichtlich ihres Potentials als in-vitro-Ersatzmethode zum Maus-Bioassay für eine hochsensitive Detektion von BSE-Prionen zu beurteilen. Dazu wurden 20 Saugkälber oral mit C-BSE infiziert und 1 Woche sowie 2, 4, 6 und 8 Monate post infectionem (MPI) euthanasiert. Die IPP sowie periphere und zentrale nervale Gewebe wurden mittels TgbovVX-Maus-Bioassay auf BSE-Infektiosität und mittels Immunhistochemie (IHC) und PMCA auf PrPBSE untersucht.   Im Verlauf dieser Studie wurde die analytische Sensitivität der verwendeten Methoden verglichen. Dabei detektierten der transgene TgbovXV-Maus-Bioassay und das PMCA-Protokoll mit vier Amplifikationsrunden BSE-Prionen bis zu einer Verdünnung von 10-8.3 des Hirnstamm-Homogenats, welches für die Infektion der Kälber genutzt wurde. Die vergleich-bare Sensitivität der PMCA zu der des TgbovXV-Maus-Bioassays ermöglicht nun dessen partiellen Ersatz und somit eine Reduzierung und Verbesserung von Bioassays, welche auf eine Überprüfung des Vorhandenseins von BSE-Prionen in Rinder-Gewebeproben abzielen. Dies wäre für zukünftige BSE-Pathogenese-Studien relevant. Es konnte so gezeigt werden, dass die PMCA grundsätzlich geeignet ist, um Gewebe mit geringen BSE-Prionen-Gehalten zu untersuchen. Diese Erkenntnisse bestätigten die Eignung dieser hochsensitiven Methoden zum Nachweis kleinster BSE-Prionen-Konzentrationen in den Rinderproben in dieser Studie.   Dabei wurden BSE-Erreger im Ileum der Rinder bereits zu einem früheren als dem bisher bekannten Zeitpunkt gefunden. BSE-Prionen waren in der IPP bereits nach 2 Monaten post infectionem (mittels TgbovXV-Maus-Bioassay und PMCA) detektierbar und mittels IHC ab 4 MPI in follikulären dendritischen Zellen der IPP-Follikel nachweisbar. Für die IPPs der meisten Kälber ab 4 MPI waren hohe Mengen an BSE-Infektiosität und mittel- bis hochgra-dig (++ bis +++) positive PMCA-Amplifikationsreaktionen nachweisbar. Diese neuen Er-kenntnisse deuten darauf hin, dass eine erleichterte BSE-Prionen-Aufnahme gemeinsam mit einer altersabhängig verbesserten Prionen-Replikation in der IPP zu solch frühen Zeitpunkten nach oraler Infektion vorliegen.   Die hier gezeigten Untersuchungen widerlegten die Hypothese, dass während der frühen Phase einer BSE-Infektion in Rindern, die nervalen Gewebe höchstwahrscheinlich frei von PrPBSE und BSE-Prionen-Infektiosität sind. Mittels IHC wurden PrPBSE-Granula in einem Plexus submucosus des enterischen Nervensystems eines Kalbes bereits nach 2 MPI detektiert. Maus-Bioassay und PMCA wiesen BSE-Prionen im Ganglion nodosum und im thorakalen Rückenmark eines Kalbes 8 Monate nach der Infektion nach. Die neuartigen Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die zentripetale Prionen-Ausbreitung nahezu unmittelbar nach der oralen Infektion beginnt. Daraufhin wurden vergleichende PMCA-Analysen von Proben des thorakalen Rückenmarks älterer Tiere durchgeführt. Diese Tiere wurden im Rahmen einer früheren Pathogenese-Studie im Alter von 4 bis 6 Monaten mit klassischer BSE infiziert. Dabei wurde eine PrPBSE-Amplifikation bereits nach 8 Monaten im thorakalen Rückenmark dieser später infizierten Tiere gefunden. Dies legt eine frühzeitig beginnende zentripetale Ausbreitung nahe. Zudem lässt dieses Ergebnis vermuten, dass die Geschwindigkeit der Neuroinvasion unabhängig vom Alter der Rinder zum Infektionszeitpunkt ist.      Schlussendlich bestätigen diese neuen Daten, dass die IPP die Eintrittspforte für das BSE-Agens und einen Ort der initialen Prionen-Vermehrung darstellt, welche nahezu direkt nach der Infektion stattfindet. Obwohl die Prionen-Aufnahme im Darm von Saugkälbern erhöht zu sein scheint, konnte diese Studie keine Hinweise auf altersabhängige Unterschiede in der Neuroinvasion bzw. weiteren Ausbreitung der C-BSE-Infektion feststellen. Die Daten ermöglichen verbesserte Risikobewertungen bezüglich des Verbraucherschutzes und des öffentlichen Gesundheitsschutzes. Außerdem erlaubt das hochsensitive PMCA-Protokoll die Reduzierung von Maus-Bioassays in zukünftigen BSE-Pathogenese-Studien.

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Ackermann, Ivett: Early pathogenesis of classical bovine spongiform encephalopathy in young calves. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule.

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