Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Biological characterization of Bovine Hepacivirus

Baron, Anna Lena

The bovine hepacivirus (BovHepV) was initially described in 2015 and added to the genus Hepacivirus as cluster N within the family Flaviviridae. Besides HCV and BovHepV, hepaciviruses were also discovered in horses, bats, rodents and sharks (hepacivirus-like), while only the equine hepacivirus (EHcV) infecting horses has been studied in more detail with respect to the IRES and the role of microRNA-122 (miR-122). The BovHepV genome was initially identified in bovine serum samples and can cause persistent infections in cows. So far, the effects of these persistent infections and the response of the humoral immune system after acute or chronic infection have not been investigated. Moreover, the possibility of interspecies transmission including zoonotic potential is uncertain. In this study, a BovHepV positive herd was screened over a time period of one year in intervals of two to three months to detect acute versus persistent infections. Nearly 20 % of the individual bovine samples contained anti-NS3-antibodies and almost 8 % had detectable viral RNA. Phylogenetic analysis resulted in the identification of an additional genetic cluster in the genus Hepacivirus. Furthermore, the anti-NS3-antibody levels were negative at each time point in persistently infected cattle. No hint at liver injury could be observed. The analysis of samples from other animal species showed that only one porcine serum sample comprised antibodies reacting with BovHepV antigen, but BovHepV RNA was not detectable. All equine and human samples contained neither BovHepV-specific RNA nor antibodies.       On the other hand on a molecular level the predicted BovHepV IRES (internal ribosome entry site) structure revealed high accordance with the HCV IRES including domains II, IIIa-IIIe, the pseudoknot IIIf and the translation initiation codon (AUG) containing domain IV. Like HCV some nucleotides of the core coding sequence are required to form domain IV. Unlike HCV, domain I is missing and only one instead of two miR-122 match sites exists in the BovHepV 5` NTR. The necessity of individual IRES domains for efficient translation and the effects of interactions between BovHepV 5` non-translated region (NTR) and core coding sequences were investigated in this study. The results indicate that (i) all IRES domains are essential for efficient translation, (ii) a predicted long-range interaction between the 5` NTR and a complementary sequence in the core coding region decreased the translation, and (iii) an adenosine-rich part in the core coding sequence seems to destabilize the AUG containing domain IV through which the translation is enhanced. Furthermore, the impact of a possible miR-122 binding at the 5` NTR on translation was analyzed. The employed human cell lines revealed an influence of miR-122 on translation, whereas in a bovine cell line a pronounced effect could not be observed. Therefore, additional functions of miR-122, for example on BovHepV replication, need to be investigated, as this micro RNA is highly expressed in the liver, contains the highest abundance of bovine hepacivirus RNA detected by RT-PCR and FISH (fluorescence in sito hybridization).

Das bovine Hepacivirus (BovHepV) wurde erstmals im Jahr 2015 beschrieben und dem Genus Hepacivirus Gruppe N in der Familie der Flaviviridae zugeordnet. Neben HCV und BovHepV wurden weitere Hepaciviren in Pferden, Fledermäusen, Nagern und Haien (hepacivirusähnlich) entdeckt, wobei das equine Hepacivirus (EHcV) als einziges, in Bezug auf die IRES und die Rolle von miR-122 (mikroRNS-122), intensiver untersucht wurde. Das BovHepV Genom wurde zunächst in bovinem Serum identifiziert und kann zu persistenten Infektion bei Rindern führen. Bisher wurden die Effekte dieser persistenten Infektionen und die Reaktion des humoralen Immunsystems nach einer akuten oder chronischen Infektion nicht untersucht. Des Weiteren ist die mögliche Übertragung auf andere Spezies, welches ein zoonotisches Potential beinhaltet, nicht bekannt. In dieser Arbeit wurde eine BovHepV positive Herde über ein Jahr in Intervallen von zwei bis drei Monaten beprobt, um eine Aussage über akute im Vergleich zu persistente Infektionen treffen zu können. Nahezu 20 % der individuellen bovinen Proben enthielten anti-NS3-Antikörper und fast 8 % wiesen nachweisbare virale RNS auf. Phylogenetische Analysen führten zu der Identifizierung einer zusätzlichen genetischen Gruppe im Genus Hepacivirus. Zu jedem Zeitpunkt besaßen persistent infizierte Rinder keine anti-NS3-Antikörper und es gab keinen Hinweis auf eine Leberschädigung. Bei der Untersuchung von anderen Tierarten besaß nur eine porcine Serumprobe reagierende Antikörper mit dem BovHepV Antigen, wobei keine BovHepV RNS nachweisbar war. Zudem hatten die equinen und humanen Proben weder BovHepV spezifische RNA noch Antikörper.       Auf molekularer Ebene, hat die vorhergesagte BovHepV IRES (internal ribosome entry site entspricht interne Ribosomeneintrittstelle)  Struktur eine hohe Ähnlichkeit mit der HCV IRES, was die Dömanen II, IIIa-IIIe, der Pseudoknoten IIIf und das in der Domäne IV vorhandene Translationsinitiationskodon (AUG) betrifft. Übereinstimmend mit HCV sind einige kapsidkodierende Nukleotide notwendig für die Ausbildung von Domäne IV. Im Gegensatz zu HCV fehlt Domäne I und es ist nur eine anstatt zwei miR-122 Bindungsstellen in der 5` NTR (nicht translatierenden Region) vorhanden. In dieser Arbeit wurde die Notwendigkeit der individuellen IRES Domänen für eine effiziente Translation und die Effekte durch Interaktionen zwischen dem BovHepV 5` NTR und der kapsidkodierenden Sequenzen untersucht. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass (i) alle IRES Domänen für eine effiziente Translation essentiell sind, (ii) eine vorhergesagte lange Reichweiteinteraktion zwischen dem 5` NTR und einer komplimentären Sequenz in der kapsidkodierenden Region zu einer verminderten Translation führt und (iii) dass ein adenosinreicher Bereich in der kapsidkodierenden Sequenz die AUG beinhaltene Domäne IV zu destabilisieren scheint, wodurch die Translation gesteigert wird. Zusätzlich wurde eine Wirkung auf die Translation durch eine mögliche miR-122 Bindung im 5` NTR untersucht. Die humanen Zelllinien zeigten einen Einfluss auf die Translation durch eine mögliche Interaktion von miR-122, wohingegen in der bovinen Zelllinie kein ausgeprägter Effekt sichtbar war. Deswegen ist es notwendig weitere Funktionen der miR-122, zum Beispiel auf die BovHepV Replikation, zu untersuchen. In der Leber ist diese mikro RNS stark exprimiert und zudem ist die größte Menge an boviner Hepacivirus RNA, detektiert durch RT-PCR und FISH (fluorescence in sito hybridzation entspricht Fluoreszenz-in sito-hybridisierung) , in diesem Organ vorhanden.

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Baron, Anna Lena: Biological characterization of Bovine Hepacivirus. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule.

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