Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Untersuchungen zur Optimierung der Kryokonservierung von Hundesperma mittels Zentrifugation und Verwendung eines Eidotter- freien Verdünners

Baumeister, Anke

The aims of the present study were 1. the use of centrifugation of the sperm-rich fraction in the procedure of dog semen cryopreservation in order to standardise the proportion of seminal plasma and the resuspension to a uniform sperm concentration (106/ml) or sperm number per 0.5 ml straw, 2. the improvement of computer-assisted sperm analysis by using an egg yolk-free and by this largely particle-free Low Density Lipoprotein (LDL) extender, 3. the recognition of individual influences on post-thaw quality of dog semen. For this, in study section I pooled semen of four healthy Beagle dogs with normospermia  was used  to evaluate centrifugation protocols using the accelerations 300 x g, 700 x g, and 1400 x g, each for 5 and 10 minutes. The resulting sperm pellets were resuspended in half with Tris-egg yolk-extender and a commercially available LDL extender (CaniFREEZE®, IMV Technologies). As cryoprotective agent glycerol was added at a final concentration of 6%. Before and after cryopreservation all samples were examined for sperm motility, integrity of acrosomal and plasma membranes and mitochondrial membrane potential (MMP) using conventional and computer-assisted methods. In a further step the centrifugation protocol (700 x g), which in the first preliminary test had turned out to bring the best results, was used in comparison with a freezing protocol working without centrifugation. There the sperm pellets of the centrifuged samples were resuspended in half to a sperm concentration of 100 x 106 and 200 x 106, resulting in 50 x 106 and 100 x 106 spermatozoa per 0.5 ml straw.   In study section II, ejaculates of 27 individual dogs of different breeds, divided into age groups ≤48 months (n=13) and >48 months (n=14) and semen quality groups (normospermia n=20, teratozoospermia n=7) were frozen by comparing the two diluents after centrifugation at 700 x g for 5 minutes and examination as described for study section I. For computer-assisted motility analysis the SpermVision® system (Minitüb, Tiefenbach), for investigation of the sperm membranes and MMP the flowcytometer Dako Galaxy ® (Agilent, Santa Clara, USA) were available.   High speed centrifugation (700 x g and 1400 x g) resulted in a higher percentage of motile sperm compared with 300 x g. Centrifugation for 5 minutes had positive effects on the integrity of acrosomal membranes and plasma membranes as well as on the MMP. Centrifugation also proved to be advantageous regarding post-thaw membrane integrity compared with not centrifuged semen. Resuspension of sperm pellets to 100 x 106 sperm/ml proved better regarding curvilinear velocity (VCL) compared with the higher concentrated samples. In the preliminary tests semen samples diluted with Tris-egg yolk extender showed significantly higher proportions of overall motile and progressively motile spermatozoa than in the LDL diluted semen, which showed, however, higher VCL. The latter finding was also observed in study section II in the average of 27 individual semen samples, whereas the percentages of overall motile and progressively motile spermatozoa were almost identical for the two diluents. Extender related differences yielded for the proportions of spermatozoa with damaged plasma membrane (Tris-egg yolk < LDL) and with damaged acrosomal membrane and plasma membrane (LDL < Tris-egg yolk), but not for the percentage of membrane intact spermatozoa. No differences in the investigated sperm parameters were found regarding the semen donors´ age. Freezing of semen showing teratozoospermia resulted in a significantly lower post-thaw proportion of spermatozoa with intact membranes compared with the normospermia samples. Based on the present results, after ejaculate evaluation centrifugation of the native sperm rich fraction with 700 x g for 5 minutes and resuspension to 100 x 106 spermatozoa/ml is recommended regarding standardization. In the present investigation the MMP did not prove to be a suitable additional parameter for assessing the quality of frozen-thawed dog semen. Despite the lower amount of particles, the LDL extender was not advantageous over the Tris-egg yolk extender regarding the assessability of frozen-thawed semen using computer- assisted methods.

Ziele der vorliegenden Studie waren 1. die Einbeziehung der Zentrifugation der nativen spermienreichen Ejakulatfraktion in das Prozedere der Tiefgefrierkonservierung von Hundesperma zur Vereinheitlichung des Seminalplasmaanteils und der Resuspension auf eine standardisierte Spermienkonzentration (106/ml)  bzw. Spermienzahl pro 0,5 ml Paillette, 2. die Optimierung der Nutzung computergestützter Spermien-Analyseverfahren durch Anwendung eines Eidotter-freien und damit weitgehend Partikel-freien Low Density Lipoprotein (LDL) Verdünners, 3. die Erfassung individueller Einflüsse auf die Tiergefrierfähigkeit von Hundesperma. Dazu wurden im Studienabschnitt I in Vorversuchen an gepooltem  Sperma von vier geschlechtsgesunden Beaglerüden mit Normospermie in drei Durchgängen Zentrifugationsprotokolle mit den Beschleunigungszahlen 300 x g, 700 x g und 1400 x g für jeweils für 5 und 10 Minuten vergleichend angewandt. Die resultierenden Samenpellets wurden je zur Hälfte mit  Tris-Eidotter Verdünner und einem kommerziell erhältlichen LDL Verdünner (CaniFREEZE®, IMV Technologies) versetzt. Als Kryoprotektivum wurde einheitlich Glycerol in einer Endkonzentration von 6% zugefügt. Alle Proben wurden vor und nach der Kryokonservierung mit konventionellen und computergestützten Untersuchungsmethoden bezüglich der Spermienmotilität, der Akrosom- und Plasmamemembranintegrität und des Mitochondrienmembranpotentials (MMP) analysiert. In einem weiteren Schritt wurde das Zentrifugationsprotokoll (700 x g für 5 Min), welches im ersten Vorversuch die besten Ergebnisse erbrachte, im  Vergleich zu  einem Einfrierprotokoll ohne Zentrifugation angewandt. Dabei wurden die Spermienpellets der zentrifugierten Proben auf  eine Spermienkonzentration von 100 x 106 oder 200 x 106 resuspendiert, so dass in einer 0,5 ml Paillette 50 x106 bzw. 100 x 106 Spermien enthalten waren.   Im Studienabschnitt II wurden die Ejakulate von 27 Rüden unterschiedlicher Rassen, aufgeteilt in die Altersgruppen ≤48 Monate (n=13) und >48 Monate (n=14) und nach Ejakulatbeschaffenheit (Normospermie n=20, Teratozoospermie n=7) unter vergleichender Anwendung beider Verdünner nach Zentrifugation bei 700 x g für 5 Minuten tiefgefroren und entsprechend der Vorgehensweise im Studienabschnitt I untersucht.  Für die computergestützte Motilitätsanalyse stand das SpermVision® System (Fa. Minitüb, Tiefenbach), für die Untersuchung der Spermienmembranen und des MMP das Durchflusszytometer Dako Galaxy® (Fa. Agilent Technologies, Santa Clara, USA) zur Verfügung.   Die Anwendung der Zentrifugationsprotokolle von 700 x g und 1400 x g resultierten in einem  höheren Anteil  an motilen Spermien im Vergleich zu 300 x g, die Zentrifugationszeit von 5 Minuten wirkte sich positiv auf die Integrität von Akrosom- und Plasmamembranen sowie auf das MMP aus.  Auch im Vergleich zu nicht zentrifugierten Proben erwies sich die Zentrifugation in Bezug auf die Membranintegrität als vorteilhaft. Die Resuspension der Spermienpellets auf  100 x 106 Spermien/ml zeigte lediglich anhand eines signifikant höheren kurvolinearen Geschwindigkeit (VCL) der Samenzellen einen Vorteil gegenüber den höher konzentrierten Proben. In den Vorversuchen waren in den mit dem Tris-Eidotter Verdünner eingefrorenen Proben signifikant höhere Anteile insgesamt und progressiv motiler Spermien als in den mit LDL Verdünnern verarbeiteten Vergleichsproben nachweisbar, in welchen jedoch die VCL höher war. Der letztgenannte Befund war auch im Studienabschnitt II im Durchschnitt der 27 individuellen Spermaproben zu verzeichnen, dagegen waren die Anteile insgesamt und progressiv motiler Spermien für beide Verdünner annähernd identisch. Verdünner-abhängige Unterschiede ergaben sich für die Anteile an Spermien mit geschädigter Plasmamembran (Tris-Eidotter < LDL) und mit geschädigter Akrosom- und Plasmamembran (LDL < Tris-Eidotter), jedoch nicht für den Anteil an Spermien mit intakten Membranen.  Bezüglich des Alters der Samenspender zeigten die untersuchten Parameter im aufgetauten Sperma keine Unterschiede. Aus dem Einfrieren von Sperma mit einem erhöhten Anteil an formabweichenden Spermien (Teratozoospermie) resultierte nach dem Auftauen ein signifikant geringerer Anteil an membranintakten Spermien als in den Vergleichsproben mit Normospermie gefunden wurden. Anhand der vorliegenden Ergebnisse ist als erster Schritt nach Erstellung des Basisspermiogramms die Zentrifugation der nativen spermienreichen Fraktion bei 700 x g für 5 Minuten und die Resuspension auf 100 x 106 Spermien/ml im Sinne einer Standardisierung zu empfehlen. In der vorliegenden Studie hat sich das MMP nicht als geeigneter zusätzlicher Parameter zur Qualitätsbeurteilung von aufgetautem Hundesperma  erwiesen. Trotz der geringeren Partikelzahl im LDL Verdünner war bezüglich der Beurteilbarkeit des aufgetauten Spermas mittels computergestützter Verfahren kein Vorteil zum Tris-Eidotter Verdünner zu erkennen. 

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Baumeister, Anke: Untersuchungen zur Optimierung der Kryokonservierung von Hundesperma mittels Zentrifugation und Verwendung eines Eidotter- freien Verdünners. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule.

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