Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Studies on pathomechanisms and novel therapies in amyotrophic lateral sclerosis

Bursch, Franziska

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is the most common adult onset motor neuron disease and is characterized by the loss of motor neurons (MNs) in the brain, brain stem and spinal cord. Most patients die within 3-5 years due to respiratory failure. The underlying pathomechanisms are poorly understood and as no cure exists novel therapeutic approaches are urgently needed.   In the first part of this study we examined the therapeutic potential of human mesenchymal stromal cells (hMSCs) via different injection routes (intrathecal vs intraspinal) in a transgenic SOD1G93A mouse model of ALS. Additionally, we studied if repeated intraspinal injections have more benefits than single injection. Besides survival time, general condition and weight loss, changes in motor performance were assessed via rotarod and footprint analysis. Analysis of spinal cord tissue and comparison of expression levels of neurotrophic factors was performed by immunohistochemistry and quantitative real time polymerase chainreaction (qRT-PCR).   Surprisingly intrathecal injection of hMSCs resulted in deterioration of disease progression whereas double intraspinal injection had benefits on motor performance. This deterioration was underlined by the finding that animals receiving hMSCs intrathecally had an increase in microgliosis.   In the second part we used induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived motor neurons from patients with known ALS causing mutations (FUS, SOD1, TDP-43 and C9orf72) and healthy controls to examine glutamatergic transmission. The glutamatergic transmission system seems to play a crucial role in the mechanisms of ALS related MNs death.  IPSC-derived MNs of ALS patients provide an optimal platform to study molecular mechanisms of ALS.   Upon application of compounds stimulating either AMPA, NMDA, kainate or metabotropic glutamate receptors we observed only slight differences in the overall number of responding MNs and in the corresponding amplitudes of the responses. QRT-PCR data revealed mutation-specific changes in expression levels of the different glutamate receptors. Furthermore, basal intracellular calcium levels were found to be increased in iPSC-derived MNs with TDP-43 and C9orf72 mutation. Spontaneously occurring calcium transients were observed with higher frequencies in C9Orf72 MNs. Raising intracellular calcium levels via the application of thapsigargin, a non-competitive inhibitor of the sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA) resulted in decreased corresponding amplitude in SOD1 MNs. Three isogenic control lines were examined to prove observed changes were mutation-specific.

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist die häufigste Motoneuronerkrankung mit Beginn im Erwachsenenalter. Sie ist gekennzeichnet durch den Verlust von Motoneuronen im Gehirn, Hirnstamm und Rückenmark. Die meisten Patienten sterben innerhalb von 3 bis 5 Jahren nach Symptombeginn an Atemstillstand. Die zugrunde liegenden Pathomechanismen sind unzureichend verstanden und da bis heute keine wirksame Therapie existiert, besteht ein dringender Bedarf an neuen therapeutischen Ansätzen.   Im ersten Teil dieser Studie haben wir das therapeutische Potenzial von humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) bei verschiedenen Applikationswegen (intrathekal vs intraspinal) in einem transgenen ALS SOD1G93A Mausmodell untersucht. Zusätzlich haben wir untersucht, ob wiederholte intraspinale Injektionen einen größeren Effekt haben als eine Einfach-Injektion. Neben der Überlebenszeit, allgemeinem Zustand und Gewichtsverlust wurden Veränderungen der motorischen Fähigkeiten durch den Rotarod-Test und Footprint- Analysen bestimmt. Motoneuronverlust, Astrozytose und Mikrogliose im Rückenmarksgewebe sowie die Expressionslevel von neurotrophen Faktoren wurden mit Hilfe von Immunhistochemie und quantitativer real time PCR untersucht.   Überraschenderweise verschlechterte die intrathekale Injektion von hMSCs den Krankheitsverlauf, während die doppelte intraspinale Injektion die motorischen Fähigkeiten verbesserte. Die Verschlechterung ließ sich durch eine vermehrte Mikrogliaaktivierung nach intrathekaler hMSC-Gabe erklären.   Im zweiten Teil untersuchten wir die glutamaterge Transmission in aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) differenzierten Motorneuronen von Patienten mit bekannten ALS verursachenden Mutationen (FUS, SOD1, TDP-43 und C9orf72) und gesunden Kontrollen. Störungen der glutamatergen Neurotransmission spielen eine wichtige Rolle in der Degeneration von Motoneuronen (MN) bei ALS. Aus iPSC differenzierte MN von ALS-Patienten stellen eine optimale Plattform für die Untersuchung molekularer Pathomechanismus der ALS dar.   Nach der Applikation von AMPA, NMDA, Kainat oder metabotrope Glutamatrezeptoren stimulierenden Substanzen beobachteten wir kleine Unterschiede in der Anzahl von reagierenden MN und der korrespondierenden Amplitude der Antwortpotenziale. QRT-PCR ergab mutationsspezifische Veränderungen im mRNA-Expressionslevel der verschiedenen Glutamatrezeptoren. Zusätzlich waren die basalen intrazellulären Kalziumlevel in MN mit TDP-43- und C9orf72-Mutationen erhöht. Spontane Kalziumanstiege wurden mit höherer Frequenz in C9orf72 MN beobachtet. Erhöhung der intrazellulären Kalziumlevel mittels der Applikation von Thapsigargin, einem nicht kompetitiven Inhibitor der Sarko/endoplasmatischen Retikulum Ca2+ ATPase (SERCA), führte zu einer Erniedrigung der zugehörigen Amplitude in Zellen mit SOD1-Mutationen. Drei isogene Kontrolllinien wurden untersucht um sicherzustellen, dass die beobachteten Veränderungen mutationsspezifisch waren.

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Bursch, Franziska: Studies on pathomechanisms and novel therapies in amyotrophic lateral sclerosis. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule.

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