Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Use of ex vivo and in vitro cultures of differentiated airway epithelial cells to analyze the infection by influenza A viruses

Fu, Yuguang

Influenza A viruses are common pathogensin the respiratory tractof many mammalian and avian species. Porcine airway epithelial cells are susceptible to infection not only by swine influenza viruses but also by human and avian influenza A viruses.Therefore, pigs may play an important role in the interspecies transmissionand have been described as “mixing vessel”. To analyze the infection of influenza A viruses in the actual target cells of the respiratory tract, we applied two culture systemsfor differentiated airway epithelial cells: precision-cut lung slices (PCLS)and air-liquid interface (ALI) culturesthat provide a suitable ex vivo andin vitrotool to analyze the interaction of influenza viruses with epithelial cells of therespiratory tract.   To analyze whetherthe ciliary activity of ciliated cells canimpedethe infection by influenza A viruses, porcine PCLS were infected with a swine influenza A virus of the H3N2 subtypeinthe presence or absence of ciliary activity. During the viral attachment step, the infectious medium was supplementedwith 2% NaCl which causesreversible ciliostasis. Viral titers were 2-or 3-fold higherat 24 h or 48 h post-infection when cells were infected under ciliostatic conditionscompared to infection of slices with ciliary activity. This result indicatesthat the ciliary beatingnot only transportsthe mucus out of the respiratorytract,italso impedesvirusinfection.   To determine the virulence of A(H1N1)pdm09 influenza viruses, strainsisolated in the years following the 2009 influenza pandemic were selected to infect ALI cultures ofdifferentiatedairway epithelial cells.Four strains isolated from human patients in 2009(2x), 2010, 2015, and one strain isolated from a pig in 2014 were applied. In the in vitroexperiments with ALI cultures, three parameters were used to determine the virulence of the viruses; (i) the amount of virus released into the supernatant, (ii) the loss of ciliated cells, (iii) reduction of the thickness of the epithelial cellslayer. The results indicatedthat the virulence of viruses of 2014/2015 was significantly lower than that of viruses from2009/2010. A similar result was obtained by a collaboration partner who compared the virulence of the five virus strains in infection trials with pigs. The viruses from2009/2010have 20amino acid exchanges in viral proteins in common that distinguish them from theviruses of 2014/2015. Ourresults suggestthat A(H1N1)pdm09influenza viruses have undergone anadaptationprocessin the years followingthe 2009pandemic, and this adaptation is associated with a loss of virulence. TheALI culture isa promising tool to predict the virulence ofinfluenza viruses which may help in the future to replace animal experiments.VI Abstract

Influenza-A-Viren sind häufige Krankheitserreger im Respirationstrakt vieler Säugetiere und Vögel.Atemwegsepithelzellen von Schweinen sind nicht nur empfänglich für die Infektion durch porzine Influenzaviren, sondern auch für die Infektion durch humane und aviäre Influenzaviren. Deshalb können Schweine eine wichtige Rolle spielen bei der Interspezies-Übertragung und werden als „Mischgefäß“ bezeichnet. Um die Infektion durch Influenza-A-Viren in den eigentlichen Zielzellen im Respirationstrakt zu untersuchen, haben wir zwei Kultursysteme für differenzierte Atemwegsepithelzellen zur Anwendung gebracht: Präzisionslungenschnitte (precision-cut lung slices, PCLS) und “air-liquid-interface” (ALI)-Kulturen, die geeignete ex vivo-und in vitro-Systeme sind, um die Interaktion von Influenzaviren mit Epithelzellen desRespirationstrakts zu untersuchen.   Um zu untersuchen, ob die Zilienaktivität der zilientragenden Zellen die Infektion durch Influenza-A-Viren behindern kann, wurden PCLS mit einem Schweineinfluenzavirus des Subtpys H3N2 infiziert, und zwar sowohl in der Gegenwart als auch in der Abwesenheit der Zilienbewegung.Für die Unterbindung der Zilienaktivität wurde dem Medium während des viralen Anheftungsprozesses 2% NaCl zugesetzt, wodurch eine reversible Ziliostase ausgelöst wird. Die Virustiter im Zellüberstandwaren 24 h oder 48 h nach der Infektion zwei bzw. dreifach höher, wenn die Zellen unter ziliostatischen Bedingungen infiziert wurden im Vergleich zu einer Infektion von Zellen mit Zilienaktivität. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Zilienaktivität nicht nur den Mukus aus dem Respirationstrakt heraustransportiert, sondern auch die Virusinfektion behindert.   Um die Virulenz von A(H1N1)pdm09 Influenza-A-Viren zu vergleichen, wurden Stämme von Influenza-A-Viren die in den Jahren nach der Influenza-Pandemie von 2009 isoliert worden waren, ausgewählt, um ALI-Kulturen differenzierter porziner Atemwegsepithelzellen zu infizieren. Vier Stämme von menschlichen Patienten waren in den Jahren 2009 (2x), 2010 und 2015 isoliert worden, ein Stamm war 2014 von einem Schwein isoliert worden. In den in vitro-Experimenten mit ALI-Kulturen wurden drei Parameter verwendet, um die Virulenz zu bestimmen: (i) die Menge der in den Zellüberstand freigestzten infektiösen Viren, (ii) der Verlust zilientragender Zellen, (iii) die Reduktion der Dicke der Epithelzellschicht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Virulenz der Viren von 2014/2015 signifikant niedriger war als jene der Viren von 2009/2010. Ein ähnliches Ergebnis wurde von einem Kollaborationspartnererzielt, der die Virulenz der fünf Virusstämme in Infektionsversuchen mit Schweinen verglich. Die Viren von 2009‘/2010 haben 20 Aminosäureaustausche gemeinsam, durch die sie sich von den Viren von 2014/2015 unterscheiden. Unsere Ergebnisse sprechen dafür, dass A(H1N1)pdm09Influenzaviren in den Jahren nach der Pandemie von 2009 einen Adaptationsprozess durchgemacht haben. Diese Adaptation ist verbunden mit einem Verlust der Virulenz. ALI-Kulturen sind ein vielversprechendes Werkzeug um die Virulenz von Influenzaviren vorherzusagen. In der Zukunft kann es dazu beitragen, Tierversuche zu ersetzen.

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Fu, Yuguang: Use of ex vivo and in vitro cultures of differentiated airway epithelial cells to analyze the infection by influenza A viruses. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule.

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