Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Grampositive Kokken von Tieren als Träger neuer und selten nachgewiesener antimikrobieller Resistenzgene

The other species of the quite speciose genus Staphylococcus are considerably less popular and less extensively studied than Staphylococcus (S.) aureus. Due to the fact that many Staphylococcus species represent a part of the physiological microbiota, staphylococci are not only in contact with staphylococci of the same species, but also with other Staphylococcus species and bacteria of other genera. As a consequence, a constantly changing resistance gene pool is available for the different bacterial species, which results in a continuous increase in the size of their resistomes. In recent years, various studies, mainly on methicillin-resistant S. aureus (MRSA), were identified a variety of novel or previously in Staphylococcus unknown resistance genes (CHAPTER 5). Of special interest is that some of these genes are even multidrug resistance genes and quite often confer resistance to critically and highly important antimicrobial agents (CHAPTER 8). At the beginning of the project, only limited information on novel and unusual antimicrobial resistance genes in coagulase-variable or coagulase-negative staphylococcal isolates of different origins was available. The aims of this study were (i) the identification of novel/unusual resistance genes in coagulase-variable or coagulase-negative staphylococci (CoNS) that showed the respective resistance phenotypes, but did not carry any of the resistance genes known in staphylococci, (ii) testing of the resistance behavior of the putative resistance genes, (iii) identification of the localization of the resistance genes on plasmids or in the chromosomal DNA, (iv) detailed analysis of the genetic environment of the resistance genes, and (v) comprehensive molecular characterization of the isolates, which harbor the same, novel or unusual resistance gene/plasmid. In the first part of the project, 26 pleuromutilin-resistant Staphylococcus isolates from cases of bovine mastitis were examined for the genetic basis of pleuromutilin resistance (CHAPTER 10). The lincosamide-pleuromutilin-streptogramin A resistance gene lsa(E) was identified in 20 isolates (MRSA n=13, CoNS n=7), being the first report of lsa(E)-positive MRSA and CoNS isolates from cases of mastitis among dairy cattle in Germany. Up to now, this in 2013 newly described multiresistance gene has been always identified as part of an enterococcal multiresistance gene cluster. In this study, 18 of 20 lsa(E)-positive isolates carried a part of this cluster. This result underlines the previous suggestion that the enterococcal multiresistance gene cluster was acquired by Staphylococcus isolates of different origins at independent occasions in Europe and Asia. In another five isolates the frequently occurring vga(A) gene was identified as the genetic basis of pleuromutilin resistance. In a single S. epidermidis isolate the gene was located on a plasmid. To gain insight into its structure and organization, the whole plasmid was sequenced. Plasmid pSWS851 had a size of 6313 bp and carried, in addition to the already detected vga(A) gene, four intact genes, that encode proteins for relaxation, mobilization or replication, as well as two incomplete replication genes. The remaining S. sciuri isolate carried the sal(A) gene, a gene newly identified in 2014. The functionality was tested by cloning and subsequent transformation into S. aureus RN4220. It could be shown that sal(A) also mediates resistance to pleuromutilins in addition to the already described streptogramin A and moderate lincosamide resistance. Two overlapping PCR assays confirmed that the sal(A) gene was also bracketed by the two housekeeping genes, lux and iscS, in the bovine S. sciuri isolate. In another study on pleuromutilin resistance in staphylococci of porcine origin from China, a variant of the vga(E) gene was identified on plasmid pSA-7 from single S. cohnii and S. simulans isolates (CHAPTER 2). This gene variant, designated as vga(E)variant, confers resistance to lincosamide-pleuromutilin-streptogramin A antibiotics as described for the original vga(E) gene, but the variant shows only 85.3 % protein identity to the original Vga(E). Besides the vga(E)variant gene, plasmid pSA-7 carried, three in part overlapping mobilization genes (mobA/B/C) and a plasmid replication gene (rep). A similar plasmid structure has been described for the apmA-carrying plasmid pKKS49 and the dfrK-carrying plasmid pKKS966. This observation suggests that a cryptic plasmid with a rep-mobA/B/C structure exists and can acquire different resistance genes. In the third study within the first part of the project, a genetic variant of the recently described macrolide-lincosamide-streptogramin B (MLSB) resistance gene erm(44) was identified in a S. saprophyticus isolate, which was isolated from the effluent of a sewage treatment plant in Eriskirch/Germany (CHAPTER 11). Based on whole genome sequencing, the genetic environment of the erm(44)-related gene was analyzed Despite comprehensive analysis, no similarities could be seen to the original erm(44)-carrying insert from S. xylosus JW4341. In addition, no structures were identified that might explain how the erm(44)-related gene was integrated into the chromosomal DNA of S. saprophyticus, or give hints towards the location of this gene variant on a formerly mobile genetic element. In the second part of the project four spectinomycin resistance plasmids have been identified, which were isolated from two S. hyicus isolates from urogenital infections of pigs and single S. chromogenes and S. equorum isolates from skin infections of pigs (Chapter 9). All four plasmids, pSWS2482, pSWS1211, pSWS118 and pSWS961, carried the novel spectinomycin resistance gene spd. Further sequence analysis of these plasmids revealed four novel types of plasmids, that differed between each other, but also to the two already known spd-carrying plasmids pDJ91S and pSWS2889. Their sizes varied between 3780 to 4229 bp and they carried different genes for plasmid replication as well as for plasmid recombination and -mobilisation. In addition, the spd gene from all four novel plasmids exhibited a deletion of one 12-bp tandem repeat at the 3'-terminus in contrast to the spd gene seen in pDJ91S and pSWS2889. However, this deletion had no impact on the resistance phenotype conferred by these plasmids as shown by determination of spectinomycin minimum inhibitory concentrations. In the course of the last part of the project, an interesting observation was made on plasmid pStrcfr from a Streptococcus suis isolate from a pig in China (CHAPTER 3). This plasmid carried the multiresistance gene cfr bracketed by two insertion sequences of the type ISEnfa5. Detailed analysis of the up- and downstream flanking regions showed that the ISEnfa5-cfr-ISEnfa5 segment was integrated into the novel lincosamide resistance gene lnu(E). As the search for an intact lnu(E) gene in naturally occurring isolates was unsuccessful, the gene was de novo synthesized and its functional activity confirmed by cloning into S. aureus. The functional activity suggests that such a gene exists and a naturally occurring, intact lnu(E) gene will also be functionally active. In conclusion, the results of this dissertation project provide information on the identification of novel resistance genes or resistance genes so far rarely seen in coagulase-variable or coagulase-negative staphylococci. Moreover, the comprehensive analysis of the genetic environment of novel resistance genes and their localization on mobile genetic elements or in the chromosome demonstrate the potential of dissemination and exchange of resistance genes in staphylococci belonging to different species and in other grampositive cocci.

Weitaus weniger populär und weniger umfassend untersucht als Staphylococcus (S.) aureus sind die übrigen Spezies des durchaus artenreichen Genus Staphylococcus. Aufgrund der Tatsache, dass viele Staphylococcus-Spezies einen Bestandteil der physiologischen Mikrobiota darstellen, stehen Staphylokokken nicht nur zu Staphylokokken der gleichen Spezies, sondern auch zu anderen Staphylococcus-Spezies und Bakterien anderer Gattungen in Kontakt. Als Folge steht den unterschiedlichen Bakterienspezies ein sich ständig im Wandel befindender Resistenzgenpool zur Verfügung, wodurch eine stetige Größenzunahme ihres Resistoms ermöglicht wird. Verschiedenste Untersuchungen in den letzten Jahren, vornehmlich an Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA), konnten diesen Wandel bestätigen und förderten eine Vielzahl an neuen oder bis dato bei Staphylococcus unbekannten Resistenzgenen zutage (KAPITEL 5). Häufig handelt es sich dabei sogar um sogenannte Multi-Resistenzgene und/oder Resistenzgene, die Resistenz gegenüber therapeutisch besonders bedeutsamen antimikrobiellen Wirkstoffen vermitteln (KAPITEL 8). Zu Beginn des Projektes waren nur sehr wenige Daten über neue und bei koagulasevariablen und/oder koagulasenegativen Staphylokokken selten nachgewiesene antimikrobielle Resistenzgene verfügbar. Die Ziele der vorliegenden Studie waren (i) die Identifizierung neuer und bislang selten nachgewiesener Resistenzgene bei koagulasevariablen und/oder koagulasenegativen Staphylococcus (KoNS) Isolaten, welche entsprechende Resistenzphänotypen zeigten, aber keine in dieser Spezies bekannten Resistenzgene aufwiesen, (ii) die Überprüfung der Resistenzverhaltens von den putativen Resistenzgenen, (iii) die Bestimmung der Lokalisation der entsprechenden Resistenzgene auf Plasmiden oder in der chromosomalen DNA, (iv) die eingehende Analyse des genetischen Umfeldes der entsprechenden Resistenzgene, sowie (v) die vollständige molekulare Charakterisierung der Isolate, die über das gleiche neue oder ungewöhnliche Resistenzgen/Resistenzplasmid verfügten. Im ersten Teil des Projektes wurden 26 Pleuromutilin-resistente Staphylococcus Isolate von Rindermastitisfällen auf ihre genetische Basis hin untersucht (KAPITEL 10). Dabei wurde bei 20 Isolaten (MRSA n=13, KoNS n=7) das Linkosamid-Pleuromutilin-Streptogramin A-Resistenzgen lsa(E) identifiziert, welches den ersten Bericht von lsa(E)-positiven MRSA und KoNS Isolaten von Rindermastitisfällen in Deutschland darstellt. Bislang wurde dieses im Jahr 2013 neu beschriebene Multi-Resistenzgen immer als Teil eines von Enterokokken stammenden Multiresistenz-Gencluster beschrieben. Auch in den lsa(E)-positiven Isolaten aus diesem Kollektiv konnten in 18 von 20 Fällen Teile des bekannten Clusters identifiziert werden. Dieses Ergebnis unterstreicht die vorherige Vermutung, dass das von Enterokokken stammende Multiresistenz-Gencluster von verschiedenen Staphylococcus ssp. Isolaten unterschiedlicher Herkünfte mehrmals unabhängig voneinander in Europa und Asien erworben wurde. Bei weiteren fünf Isolaten wurde das häufig vorkommende vga(A) Gen als genetische Basis für Pleuromutilinresistenz identifiziert. In einem S. epidermidis Isolat lag das Gen Plasmid-lokalisiert vor. Um einen Einblick in dessen Struktur und Organisation zu erlangen, wurde das gesamte Plasmid sequenziert. Das Plasmid pSWS851 wies eine Größe von 6313 bp auf und trug, neben dem bereits detektierten vga(A) Gen, vier intakte Gene, die für Proteine kodieren, welche an der Relaxation, Mobilisierung oder Replikation des Plasmids beteiligt sind. Hinzu kommen noch zwei unvollständige Gene, die ebenfalls für Replikationsproteine kodieren. Das verbleibende S. sciuri Isolat trug das im Jahr 2014 identifizierte sal(A) Gen. Mittels Klonierung und anschließender Transformation in S. aureus RN4220 wurde gezeigt, dass dieses Gen neben der bereits beschriebenen Streptogramin A und moderaten Linkosamid Resistenz auch Resistenz gegenüber Pleuromutilinen vermittelt. Zwei überlappende PCR Assays bestätigten, dass das sal(A) Gen auch in diesem Isolat von den beiden Haushaltsgenen, lux und iscS, umrahmt ist. In einer weiteren Studie zur Pleuromutilinresistenz bei Staphylokokken von Schweinen aus China wurde eine vga(E) Genvariante auf dem Plasmid pSA-7 eines S. cohnii und eines S. simulans Isolats entdeckt (KAPITEL 2). Diese als vga(E)variant bezeichnete Genvariante vermittelt wie das Originalgen vga(E) Resistenz gegenüber Linkosamiden-Pleuromutilinen-Streptogramin A und weist nur eine Proteinidentität von 85,3 % zu dem Originalgen auf. Das Plasmid pSA-7 wies neben dem vga(E)variant Gen noch drei teilweise sich überlappende Mobilisierungsgene (mobA/B/C) und ein Plasmidreplikationsgen (rep) auf. Eine ähnliche Plasmidstruktur wurde bereits auf dem apmA-tragenden Plasmid pKKS49 und dem dfrK-tragenden Plasmid pKKS966 analysiert. Diese Beobachtung deutet daraufhin, dass ein kryptisches Plasmid mit der rep-mobA/B/C Struktur existiert, welches unterschiedliche Resistenzgene aufnehmen kann. In der dritten Studie des ersten Projektteils wurde eine Genvariante des erst kürzlich identifizierten Makrolid-Linkosamid-Strepotgramin B (MLSB)-Resistenzgens erm(44) in einem S. saprophyticus Isolat, welches aus dem Abwasser der Kläranlage Eriskirch in Deutschland stammt, identifiziert (KAPITEL 11). Mittels Gesamtgenomsequenzierung wurde das genetische Umfeld der erm(44) Genvariante näher analysiert. Auch nach umfangreicher Analyse ließen sich keinerlei Ähnlichkeiten zu dem das Originalgen erm(44)-tragenden Insert aus S. xylosus JW4341 erkennen. Darüber hinaus wurden keine Strukturen identifiziert, die erklären könnten, wie die erm(44) Genvariante in die chromosomale DNA von S. saprophyticus integriert wurde, oder die Hinweise auf eine Lokalisation auf einem früheren mobilen genetischen Element liefern könnten. Im zweiten Teil des Projektes wurden vier Spectinomycin-resistente Plasmide ermittelt, die aus zwei S. hyicus Isolaten von Urogenitalinfektionen vom Schwein und aus einem S. chromogenes und einem S. equorum Isolat von Hautinfektionen beim Schwein stammten (KAPITEL 9). Alle vier Plasmide, pSWS2482, pSWS1211, pSWS118 und pSWS961, trugen das neue Spectinomycin-Resistenzgen spd. Nähere Sequenzanalysen der Plasmide ergaben vier neue Plasmidtypen, die sich untereinander und zu den beiden bereits bekannten Plasmiden pDJ91S und pSWS2889 durch unterschiedliche Gene für Plasmidreplikation sowie für Plasmidrekombination und –mobilisierung unterschieden. Ihre Größe variierte dabei zwischen 3780 und 4229 bp. Darüber hinaus wies das spd Gen aller vier neuen Plasmide, im Gegensatz zum spd Genprototyp von pDJ91S und pSWS2889, eine Deletion eines 12 bp großem Tandem-Repeats am 3‘-Terminus auf. Es konnte jedoch mittels Empfindlichkeitstestung gezeigt werden, dass diese Deletion keinen Einfluss auf die Höhe der minimalen Hemmkonzentration für Spectinomycin hat. Im Rahmen des letzten Projektteils wurde eine besondere Beobachtung auf dem Plasmid pStrcfr aus einem Streptococcus suis Isolat von einem Schwein in China gemacht (KAPITEL 3). Dieses Plasmid trägt das Multi-Resistenzgen cfr, welches auf diesem Plasmid von zwei Insertionssequenzen des Typs ISEnfa5 flankiert ist. Nähere Analysen der stromauf- und stromabwärts flankierenden Regionen ergaben, dass das ISEnfa5-cfr-ISEnfa5-Segment in das neue Linkosamid-Resistenzgen lnu(E) integriert wurde. Da die Suche nach einem intakten lnu(E) Gen bislang erfolglos verlief, wurde dieses Gen de novo synthetisiert und seine funktionelle Aktivität mittels Klonierung in S. aureus überprüft. Die Bestätigung der funktionellen Aktivität lässt vermuten, dass ein solches Gen existiert und der intakte natürlich vorkommende lnu(E) Leserahmen ebenfalls funktionell aktiv ist. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Ergebnisse dieses Projektes nicht nur einen umfassenden Beitrag zur Identifizierung neuer oder für koagulasevariable und/oder koagulasenegative Staphylokokken bislang selten nachgewiesene Resistenzgene darstellen. Vielmehr gibt die umfassende Analyse des genetischen Umfeldes der neuen Resistenzgene und deren Lokalisationsbestimmung auf mobilen genetischen Elementen oder in der chromosomalen DNA Aufschluss über das Verbreitungs- und Austauschpotential von Resistenzeigenschaften bei Staphylokokken und anderen grampositiven Kokken.


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