Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Interactions of spermatozoa with leukocytes and epithelial cells in the porcine uterus

Modern biotechnological procedures, such as sex sorting of spermatozoa, require deep intra-uterine insemination of sperm portions containing no more then 50 x 106 spermatozoa. It proves that circumventing the uterus results in satisfying fertility rates even if only 1/50 of the usual sperm concentration is used. To facilitate insemination with small sperm doses also for conventional AI-techniques, more knowledge has to be gathered about fundamental sperm transport and selection mechanisms within the uterus. The aim of the present study was to analyse in the pig the interactions of spermatozoa with uterine epithelial cells and intra-luminal neutrophilic granulocytes, considering that they might play a role in sperm selection. Especially neutrophils seem to participate actively in this process. Therefore, the effect of inseminate components on the recruitment of PMN into the uterus was also to be investigated. Thus the following hypotheses were postulated: 1.      Interactions of spermatozoa with uterine epithelial cells and neutrophilic granulocytes are selective and can be modulated by seminal plasma. 2.      The interactions between spermatozoa and neutrophilic granulocytes are lectin-mediated. 3.      Seminal plasma, spermatozoa and semen extender modulate the influx of neutrophilic granulocytes. To study under near natural conditions whether interaction between spermatozoa and uterine epithelial cells actually take place, an ex vivo model was established. Uterine segments (10 cm) from freshly slaughtered pre-or postovulatory juvenile gilts were inseminated with 100 x 108 spermatozoa and subsequently incubated for 60 min at 38°C. For this purpose the sperm cells were either diluted in autologous seminal plasma or washed and resuspended in Androhep™. After incubation spermatozoa were flushed out, counted flow cytometrically and examined for changes in viability and mitochondrial membrane potential (MMP) using the fluorescent stains propidium iodide and JC-1 respectively. Combining the results, significantly less spermatozoa with a functioning MMP and intact plasma membranes could be retrieved compared to what had been put in (55 ± 7%), while the number of damaged spermatozoa hardly changed (93±12%), indicating a retention of viable sperm cells in the uterine lumen by an active binding process.  There was no apparent difference between pre- and postovulatory uteri. However, significantly more spermatozoa were retained if they had been washed and diluted in Androhep before incubation compared to the untreated spermatozoa, which implies that seminal plasma inhibits the binding to a certain extent. The trials concerning the interactions between porcine PMN and spermatozoa were conducted in vitro. Using coincubation assays, the following sperm preparations were tested for their binding potential to neutrophilic granulocytes: 1. untreated and seminal plasma - diluted spermatozoa, 2. washed and Androhep™ - diluted spermatozoa, 3. sodium fluoride – immobilised spermatozoa, 4. membrane-damaged spermatozoa. The assays revealed that neutrophils bind to a subpopulation of viable spermatozoa.  More spermatozoa were bound if they had been washed beforehand (45±3%) compared to untreated semen (30±5.7%) suggesting an inhibiting effect of seminal plasma. A binding of membrane-damaged sperm cells to PMN was virtually non existent (3±2%). The attachment of sodium fluoride-immobilized spermatozoa was limited to 20±2%, thus implying that motility too plays a role in the matter. Interestingly, even after 1 hour of incubation, no phagocytosis of bound sperm cells was witnessed. This finding suggests that either the set ups were lacking impulses for phagocytosis such as complement factors or antibodies, but then it seems surprising that the spermatozoa bound at all. On the other hand it might not be phagocytosis which is intended to happen. One possible option is the induction of apoptosis in the bound spermatozoa, since it does not elicit such an aggressive immunological reaction. On the other hand it is also feasible that the connection between spermatozoa and neutrophils is transient and might not have negative consequences for the spermatozoa at all. Perhaps they are marked during the process or they receive impulses for further maturation. Concerning the molecular base of the interaction between spermatozoa and PMN, the findings of the present study suggest that it is most likely not lectin-dependent. Although both viable cell types were shown to express a broad range of different lectin-binding sugar residues, none of the lectins tested was able to selectively block PMN-sperm binding significantly. As the results of our in vitro trials confirmed, sperm-PMN-interactions might have consequence for the availability of viable spermatozoa for fertilization. How the migration of neutrophils into the uterus is regulated though, is not yet fully understood. For this reason the next part of the study was designed to examine the influence of several inseminate constituents on neutrophil migration. In vivo trials were carried out measuring the PMN influx after inseminating with various combinations of seminal plasma (SP), semen extender Androhep™ (AH) and sperm preparations (S). Inseminations with preparations containing 98% AH caused the most prominent PMN migration. In preovulatory gilts inseminated the influx was not influenced by the presence or absence of spermatozoa (AH: 628±189x106 leukocytes/uterine horn; AH+S 580±153x106). After ovulation spermatozoa seemed able to lower the PMN-migration (AH: 569±198x106, AH+S: 162±102 x106). If the liquid part of the inseminates consisted of 98% seminal plasma the numbers of recruited uterine leukocytes stayed well below these heights. Diluted in seminal plasma spermatozoa caused no significant rise or decrease in the number of migrated PMN irrespective whether insemination took place before (SP: 14±6x106, SP+S: 73±27x106) or after ovulation (SP: 60±32x106, SP+S: 51±33x106). Due to high variances PBS inseminated gilts (preovulatory: 1±1x106, postovulatory: 11±9x106) did not elicit a significantly lower influx than gilts inseminated with seminal plasma, even though a tendency was visible. All semen constituents previously tested in vivo were examined in flanking in vitro trials to be able to differentiate between direct and indirect migration regulating properties. In quantitative transmigration assays Androhep™, spermatozoa supernatant and seminal plasma were tested for the ability to boost or inhibit the migration of blood-derived PMN. Surprisingly, Androhep™ significantly inhibited the transmigration towards recombinant human Interleukin-8 (rhCXCL8) (AH: 14±5% migration rate versus controls: 37±6%, p<0.05). Further trials revealed that the chelator citrate, a constituent of Androhep™, caused the inhibition by withdrawing the free calcium ions necessary for PMN migration. It has to be concluded that the leukocyte migration into the uterus after insemination with the semen extender is not a result of direct chemotaxis but most likely an indirect effect due to stimulation of endometrial cells. Since only soluble molecules can have chemoattractive properties spermatozoa as a whole cannot influence migration. Thus supernatants of spermatozoa incubated in PBS for 1, 12 or 24 h were tested for their effect on transmigration. They showed neither chemoattractive nor chemotaxis inhibiting properties, thus providing strong evidence that the influence of spermatozoa on migration as shown in vivo is exercised indirectly via interactions with uterine epithelial cells. Transmigration assays with seminal plasma showed off its anti-inflammatory properties. For once, it significantly inhibited the in vitro transmigration of PMN at ≥ 0.1% [v/v]. Furthermore, seminal plasma in concentrations of ≥ 5% [v/v] caused neutrophils to form aggregates which grew in size in a dose dependant manner. In conclusion the present study revealed that interactions of spermatozoa with uterine epithelial cells and neutrophilic granulocytes respectively have the potential to have a considerable impact on sperm selection since they target the viable, i.e. prospective fertilising part of the sperm population. Seminal plasma showed the ability to influence both interactions to a certain degree. Thus the first of our hypotheses can be accepted. Concerning the modus of interaction between spermatozoa and neutrophils our trials indicated that it is most likely not facilitated by lectins as we had proposed in the second hypothesis, which now has to be rejected. Furthermore we proved that seminal plasma, spermatozoa and the boar semen extender Androhep™ modulate the PMN-influx after insemination supporting the third hypothesis. Androhep™ in comparison with seminal plasma exacerbates the influx. Currently it is not possible to judge whether the magnitude of the PMN-influx is of importance for the fertility rates after inseminating with small sperm dosages. Further research will be necessary to elicit the consequences of the sperm-PMN-interactions.

Moderne biotechnologische Verfahren wie die geschlechtsspezifische Sortierung von Spermien erfordern den Einsatz von Besamungsportionen, die maximal 50 x 106 Spermatozoen enthalten. Beim Schwein ist eine erfolgreiche Besamung mit derartig geringer Spermienkonzentration nur möglich, wenn sie tief intrauterin erfolgt. Dies bedeutet, dass etwa 1/50 der Spermien zu akzeptablen Befruchtungsraten führen, wenn man den Spermientransport durch den Uterus umgeht. Um künstliche Besamung mit geringer Spermienkonzentration auch mit der konventionellen Technik zu ermöglichen, müssen fundamentale Mechanismen der uterinen Spermienselektion und des Spermientransports geklärt werden. Ziel dieser Studie ist es, beim Schwein die Interaktionen zwischen Spermien und uterinen Epithelzellen bzw. intraluminalen Leukozyten zu analysieren, soweit sie im Rahmen der Spermienselektion eine Rolle spielen könnten. Insbesondere neutrophile Granulozyten scheinen hierbei eine aktive Funktion zu übernehmen. Im Einzelnen wurden die folgenden Hypothesen aufgestellt: 1.      Interaktionen von Spermien mit uterinen Epithelzellen und neutrophilen Granulozyten sind selektiv und werden durch Seminalplasma moduliert. 2.      Interaktionen zwischen Spermien und neutrophilen Granulozyten werden durch Lektin vermittelt. 3.      Seminalplasma, Spermien und Spermienverdünner modulieren den Einstrom neutrophiler Granulozyten in den Uterus. Zunächst wurde ein Ex-Vivo-Modell etabliert, um Interaktionen zwischen Spermien und uterinen Epithelzellen unter möglichst naturnahen Bedingungen studieren zu können. Dafür wurden Uteri von frisch geschlachteten prä- bzw. postovulatorischen Jungsauen in ca. 10 cm lange Segmente unterteilt. Jedes Segment wurde mit 1 x 108 Spermien besamt und für 60 min bei 38°C im Wasserbad inkubiert. Die dafür verwendeten Spermien wurden entweder mit autologem Seminalplasma verdünnt oder zuvor gewaschen und im Ebersamenverdünner Androhep™ resuspendiert. Nach Inkubation wurden die Spermien aus den Uterussegmenten herausgespült und durchflusszytometrisch gezählt. Darüber hinaus wurden sie mittels der Flourochrome Propidiumjodid und JC-1 auf Änderungen hinsichtlich ihrer Membranintegrität und ihres Mitochondrienmembranpotentials (MMP) untersucht. Dabei wurden signifikant weniger Spermien mit intakter Membran und bestehendem MMP erspült als ursprünglich hinein gegeben worden waren (55±7%), während von den von vornherein toten Spermien fast alle Spermien wieder herausgespült werden konnten (93±12%). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass vor allem vitale Spermien im Uterus zurückgehalten werden, vermutlich als Resultat einer aktiven Bindung an die Epithelzellen. Es konnten keine Unterschiede zwischen prä- und postovulatorischen Uteri festgestellt werden. Allerdings verblieben gewaschene Spermien eher im Uterus, als in Seminalplasma verdünnte unbehandelte Spermien. Dieses lässt auf eine partielle Inhibition dieser Bindung durch Seminalplasma schließen. Die Untersuchung von Spermien-Leukozyten-Interaktionen erfolgte anhand von In-Vitro- Koinkubationsversuchen. Es wurde getestet, in welchem Unfang verschiedene Spermienpräparationen an neutrophile Granulozyten binden. Dazu wurden Spermien wie folgt behandelt: 1. unbehandelt und in Seminalplasma verdünnt; 2. gewaschen und in Androhep™ verdünnt; 3. immobilisiert mittels Natriumfluorid; 4. gezielte Membranschädigung mittels Ultraschall oder plötzlichem Einfrieren und Auftauen. Die Versuche zeigten, dass präferentiell vitale Spermien an Neutrophile binden. Dabei wurden gewaschene Spermien eher gebunden (45±3%) als unbehandelte (30±5.7%). Offenbar wirkt Seminalplasma auch in diesem Fall hemmend auf die Bindung. Membrangeschädigte Spermien wurden so gut wie gar nicht gebunden (3±2%), während Immobilisation die Bindung auf 20±2% reduzierte. Dies impliziert, dass Motilität ebenfalls von Bedeutung für die Bindung von Spermien an PMN ist. Interessanterweise wurde auch nach einstündiger Inkubationszeit lediglich Bindung, aber keine eigentliche Phagozytose beobachtet. Entweder fehlten also die Impulse für eine Phagozytose (z.B. in Form von Komplementfaktoren oder Antikörpern, wobei sich dann die Frage stellt, warum die Spermien überhaupt banden) oder Phagozytose ist nicht das eigentliche Ziel dieser Bindung. Möglicherweise führt die Bindung zur Induktion von Apoptose bei den betroffenen Spermien, eventuell um eine massive Entzündungsreaktion zu unterbinden, die in Massen sterbende Neutrophile zweifellos auslösen würden. Ebenfalls muss in Betracht gezogen werden, dass die Bindung zwischen Spermien und Neutrophilen transient sein könnte und nicht unbedingt negative Folgen für die Spermien haben muss. Eventuell werden Spermien dadurch markiert oder erhalten Impulse für die weitere Reifung. Untersuchungen zur Klärung des Bindungsmodus zwischen Spermien und PMN ergaben, dass die Bindung mit großer Wahrscheinlichkeit nicht Lektin-vermittelt ist. Obwohl beide Partner eine große Bandbreite Lektin-bindender Zuckerreste aufwiesen, konnte keines der getesteten Lektine die Bindung zwischen Spermien und Neutrophilen blockieren. Die Resultate unserer In-Vitro-Versuche bestätigen: Wenn neutrophile Granulozyten im Uterus sind, hat dies Konsequenzen für die Verfügbarkeit vitaler Spermien für die Befruchtung. Mit dem derzeitigen Wissen ist eine echte Regulierung des PMN-Einstromes jedoch nicht möglich. Um weitere Kenntnisse darüber zu gewinnen, wurden In-Vivo-Versuche durchgeführt. Dabei sollte festgestellt werden, in welchem Umfang Spermien im Uterus eigentlich Leukozyten ausgesetzt sind und inwieweit verschiedene Bestandteile einer Besamungsportion den Einstrom der Immunzellen beeinflussen können. Dazu wurden Jungsauen prä- oder postovulatorisch mit Präparationen inseminiert, die Seminalplasma (SP),  Androhep™ (AH) und Spermien (S) in verschiedenen Kombinationen enthielten. Der 3 Stunden nach Besamung observierte Leukozyteneinstrom bestand im Wesentlichen aus neutrophilen Granulozyten. Inseminate, die zu 98% aus Androhep™ bestanden, verursachten den massivsten Einstrom von Leukozyten. Bei präovulatorischen Sauen war es unwesentlich, ob die Besamungsportion darüber hinaus auch Spermien enthielt (AH: 628±189x106 Leukozyten/Uterushorn; AH+S 580±153x106). Inseminiert nach Ovulation schienen Spermien durchaus einen regulativen Einfluss auszuüben (AH: 569±198x106, AH+S: 162±102 x106). Wenn der flüssige Anteil des Inseminates dagegen zu 98% aus Seminalplasma bestand, blieb der Einstrom deutlich unter den oben genannten Werten. Die Anwesenheit von Spermien schien keine prominente Rolle zu spielen, egal ob die Sauen vor (SP: 14±6x106, SP+S: 73±27x106) oder nach Ovulation (SP: 60±32x106, SP+S: 51±33x106) besamt wurden. Auf Grund hoher Varianzen unterschied sich der Leukozyteneinstrom nach Besamung mit Seminalplasma nicht signifikant vom Einstrom verursacht durch PBS (präovulatorisch: 1±1x106, postovulatorisch: 11±9x106), aber eine Tendenz war klar erkennbar. Alle bereits in den In-Vivo-Besamungsversuchen getesteten Substanzen wurden ebenfalls in quantitativen In-Vitro-Transmigrationsversuchen auf ihre chemoattraktiven Eigenschaften untersucht, um in vivo zwischen direkter und indirekter Immunregulation differenzieren zu können. Dabei wurden Androhep™, Spermienüberstand and Seminalplasma hinsichtlich ihrer Fähigkeiten geprüft, die Transmigration neutrophiler Granulozyten aus dem peripheren Blut entweder zu fördern oder zu hemmen. Erstaunlicherweise ergaben die Versuche, dass Androhep™ die Interleukin-8-stimulierte Transmigration signifikant zu hemmen vermochte. (Migrationsrate mit AH: 14±5% verglichen mit Kontrollen: 37±6%, p<0.05). Weitere Versuche belegten, dass die Androhepkomponente Zitrat in ihrer Eigenschaft als Chelator die Hemmung verursachte, indem es die für die Transmigration essentiellen freien Kalziumionen band. Hinsichtlich der massiven Leukozytenmigration in den Uterus nach Besamung mit Androhep™ muss man schließen, dass dies nicht Resultat einer direkten chemoattraktiven Wirkung des Ebersamenverdünners sein kann. Vielmehr muss von einem indirekten Effekt durch Stimulierung der uterinen Epithelzellen ausgegangen werden. Da nur Moleküle chemotaktisch wirken können, kommen Spermien in toto nicht als Auslöser direkter Transmigration in Frage. Wohl aber können Überstande von Spermieninkubaten solche Botenstoffe enthalten. Aus diesem Grund wurden Spermien in PBS 1, 12 bzw. 24 Stunden inkubiert und die Überstande hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Transmigration neutrophiler Granulozyten untersucht. Da keiner der genannten Überstande die Transmigration in positiver oder negativer Weise beeinflusste, ist es wahrscheinlich, dass die in vivo beobachtete Regulation durch Spermien auf indirekte Weise vermittelt wird, zum Beispiel über Interaktionen mit uterinen Epithelzellen. Transmigrationsversuche mit Seminalplasma offenbarten anti-inflammatorische Eigenschaften. Erstens inhibierte es bereits ab einer Konzentration von ≥ 0.1% [v/v] die Transmigration signifikant. Außerdem kam es ab 5% [v/v] Seminalplasma zu einer Agglutination von Neutrophilen. Dieser Effekt wurde mit zunehmender Konzentration deutlicher. Zusammengefasst lässt sich aus den Ergebnissen der vorliegenden Studie schließen: Interaktionen von Spermien mit uterinen Epithelzellen bzw. neutrophilen Granulozyten besitzen das Potenzial, die Spermienselektion erheblich zu beeinflussen, da vorrangig vitale, also befruchtungskompetente Spermien in die Prozesse involviert waren. Darüber hinaus ist Seminalplasma in der Lage, beide Bindungen bis zu einem gewissen Grad zu hemmen. Damit hat sich die erste der gestellten Hypothesen als richtig erwiesen. Des Weiteren ergaben die Untersuchungen, dass die Bindung zwischen Spermien und neutrophilen Granulozyten höchstwahrscheinlich nicht Lektin-vermittelt ist, womit die zweite Hypothese zurückgewiesen werden muss.  Es konnte außerdem nachgewiesen werden, dass Seminalplasma, Spermien und der Ebersamenverdünner Androhep™ in unterschiedlichem Ausmaß zu einer Modulation des PMN-Einstromes nach Besamung führen, wie in der dritten Hypothese vermutet wurde. Androhep™ führt im Vergleich mit Seminalplasma zu einem überproportionalen Anstieg der Migration neutrophiler Granulozyten in den Uterus. Es ist momentan nicht möglich zu beurteilen, ob die Höhe des PMN-Einstroms für die Befruchtungsrate nach Besamung mit kleinen Spermiendosen von Bedeutung ist. Weitere Forschung ist nötig, um zu klären, wie sich Interaktionen mit PMN auf die Spermienvitalität auswirken.


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