Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Katrin Simon

 

In vitro Untersuchungen zur Kapazitation caniner Spermien und deren Regulation durch das Ovidukt

 

title (engl.)

In vitro studies of capacitation of canine sperm and its regulation by the oviduct

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2002

text

/dissertations/simonk_2002.pdf

abstract (deutsch)

Unmittelbar nach der Ejakulation sind Spermatozoen noch nicht voll befruchtungsfähig. Im weiblichen Genitale müssen sie erst noch den Prozess der Kapazitation, eine Serie zellulärer und molekularer Modifikationen, durchlaufen. Diese Ereignisse finden im Wesentlichen im Isthmus des Ovidukts statt. Dort werden die Samenzellen unter Ausbildung eines engen Kontakts zum Epithel gespeichert und der Ablauf der Kapazitation mit dem Eintreten der Ovulation koordiniert.

 

Ziele der vorliegenden Studie waren:

1.   Die Charakterisierung des Kapazitationsverlaufs caniner Spermatozoen.

2.   Die Untersuchung des Einflusses des Oviduktepithels auf die Überlebensfähigkeit der Spermien und auf definierte Marker der Kapazitationssequenz.

3.      3.      Der Vergleich der Regulation der Spermienfunktion bei Bindung an heterologem oder homologem Oviduktepithel.

 

Methoden:

  1. Canine Spermien wurden unter kapazitativen Bedingungen 6h im Tyrodemedium inkubiert. Der Verlauf der Kapazitation und die kapazitationsabhängigen Parameter Membranintegrität, cytosoler Calciumgehalt und die Tyrosin-phosphorylierung von Plasmamembranproteinen wurden nach 3, 30, 60, 90, 180, 240 und 360min mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen (CTC, PI, Fluo- 3 AM und Cy 3) untersucht. Zusätzlich erfolgten computergestützte Motilitätsmessungen.
  2. Canine Spermatozoen wurden mit primären porcinen Oviduktepithelzellkulturen koinkubiert und der Einfluss des Epithels auf die genannten Parameter bei gebundenen und freischwimmenden Spermien analysiert.
  3. Es erfolgte eine vergleichende Koinkubation der Spermien mit Oviduktexplanten postpuberaler Sauen und mit Oviduktexplanten östrischer Hündinnen. Nach 3, 30, 90, 180 und 360min Inkubationszeit wurden die Anzahl epithelgebundener Spermien und der Status der Tyrosinphosphorylierung bestimmt.

 

Ergebnisse:

  1. Die Anteile kapazitierter und akrosomenreagierter Spermatozoen nahmen bei 6stündiger Inkubation im Tyrode- Medium signifikant zu. Der Prozentsatz membrandefekter Spermien nahm bei gleichzeitiger Abnahme der Motilität zu. Der Anteil der Zellen mit erhöhtem intrazellulärem Calciumgehalt stieg ebenfalls an. Während der Inkubation war eine Tyrosinphosphorylierung von Membran-proteinen am Spermienschwanz und eine nachfolgende Phosphorylierung am Kopf zu beobachten. Die Schwanzphosphorylierung korrelierte mit den auf eine Hyperaktivierung bezogenen Motilitätsparametern.
  2. Die an porcines Oviduktepithel gebundenen Spermien waren unkapazitiert, zeigten kaum Motilitätsverlust und Membrandefekte. Bei den Ungebundenen nahmen die Anteile kapazitierter, akrosomenreagierter und membrandefekter Spermatozoen deutlich zu. Gleichzeitig nahm die Motilität ab. Der Prozentsatz der Zellen mit erhöhtem Calciumgehalt stieg bei den ungebundenen Spermien von Beginn der Inkubation an. Bei den Gebundenen nahm er stark verzögert zu. Bei Gebundenen und Ungebundenen traten gleichermaßen Schwanzphos-phorylierungen auf, wobei diese Anteile bei den gebundenen Spermien schneller anstiegen. Kopfphosphorylierte Zellen waren bei den Gebundenen nur minimal vertreten, während dieser Prozentsatz bei den Ungebundenen deutlich zunahm.
  3. Canine Spermien banden in vergleichbarer Anzahl an homologen und hetero-logen Explanten. Hinsichtlich des Einflusses auf die Kinetik der Tyrosinphospho-rylierung bestanden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Systemen.

 

Der Kapazitationsablauf caniner Spermien beinhaltet Veränderungen, wie sie bereits bei anderen Spezies beschrieben wurden. Zusätzlich wurde deutlich, dass die Tyrosinphosphorylierung von Geißelmembranproteinen im Zusammenhang zur Hyperaktivierung steht. Durch die Bindung am Oviduktepithel wird auch bei caninen Spermatozoen eine vitale und motile Spermienpopulation selektiert mit niedrigem cytosolem Calciumgehalt und unterdrückter Tyrosinphosphorylierung am Kopf. Der vitalitätserhaltende und kapazitationsverzögernde Effekt der Epithelbindung scheint unabhängig davon zu sein, von welcher Spezies das Oviduktepithel stammt.

 

abstract (englisch)

Immediately after ejaculation, sperm are not able to fertilize the egg. Before they acquire this ability, they have to undergo capacitation. The latter represents a series of cellular and molecular changes in the sperm cell priming it for the acrosome reaction and fertilization. Essential steps of capacitation take place in the oviductal isthmus. In this region sperm are stored in close contact to the oviductal epithelium and the progress of capacitation is coordinated with ovulation.

 

Aims of this study have been:

1.      1.      The description of the capacitation process in canine sperm.

  1. The examination of the effect of sperm binding to oviductal epithelium on viability and defined capacitational events.
  2. The control of sperm function by heterologous and homologous oviductal epithelium should be compared.

 

Methods:

1.      1.      Sperm were incubated for 6h under capacitating conditions in a complete bicarbonate Tyrode´s medium. After 3, 30, 60, 90, 180, 240 and 360min the capacitation state and capacitation- dependent parameters (as membrane integrity, intracellular calcium concentration and tyrosine phosphorylation of plasma membrane proteins) were examined using fluorescent probes (CTC, propidium iodide, Fluo- 3 AM and Cy 3). Parallely computer- assisted motility analysis was performed.

2.      2.      Canine sperm were coincubated with porcine oviductal epithelial cell cultures and the effect of the epithelium on the above- mentioned parameters in bound and free- swimming sperm was analyzed.

  1. Sperm were coincubated with oviductal explants of postpuberal sows on the one hand and to explants of oestrous bitches on the other. The number of bound sperm and the state of tyrosine phosphorylation were determined after 3, 30, 90, 180 and 360min of incubation.

 

Results:

  1. During 6h of incubation in Tyrode´s medium, the percentage of capacitated and acrosome reacted cells rose significantly. The number of sperm showing membrane defects increased, linked to a decrease of motility. In the same time the percentage of cells with a high content of intracellular calcium rose. During incubation sperm cells were first tyrosine phosphorylated on tail membrane proteins and secondly on head membrane proteins. Tyrosine phosphorylation of the tail correlated to motility parameters related to hyperactivation.
  2. Sperm bound to porcine oviductal epithelium were mainly uncapacitated, showed higher motility levels and low levels of membrane defect cells. In unbound sperm the proportions of capacitated, acrosome reacted and membrane defect cells increased distinctly, while motility decreased. In contrast to unbound spermatozoa, bound showed a delayed increase of intracellular calcium. Tyrosine phosphorylation of tail membrane proteins was comparable in bound and unbound sperm cells, but increased at a faster rate in bound. Only a few bound sperm were phosphorylated on the head. In opposite, this percentage rose significantly in unbound sperm.
  3. Canine sperm bound in similar numbers to homologous and heterologous explants. There were no differences with respect to kinetics of tyrosine phosphorylation in both systems.

 

The course of capacitation in canine sperm implicates changes, as they are described for other species. Additionally was demonstrated, that tyrosine phosphorylation of tail membrane proteins is connected to hyperactivation. In canine sperm there is also a selection of a population of viable and motile sperm, showing a low content of cytosolic calcium and a suppressed tyrosine phosphorylation of head membrane proteins. This preservation of vitality and delay of capacitation by binding to the epithelium seems to be independent from which species oviductal epithelium was obtained.

 

keywords

Kapazitation, Hundespermien, Tyrosinphosphorylierung, capacitation, dog sperm, tyrosine phosphprylation

kb

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