Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Nazeer Hussain Kalhoro

 

Generation and Evaluation of a DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) Vector Vaccines for Protection of Poultry against Avian Influenza virus infections

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-96364

title (ger.)

Herstellung und Evaluierung von DIVA (Unterscheidung von infizierten und vakzinierten Tieren ) Vektor-Impfstoffen zum Schutz des Geflügels vor Infektionen mit aviären Influenzaviren

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2008

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/kalhoron_ws08.pdf

abstract (deutsch)

Aviäre Influenzaviren (AIV) stellen eine permanente Bedrohung für Geflügel dar und einige Stämme besitzen zudem ein hohes zoonotisches Potential. Eine generelle Vakzinierung von Geflügelbeständen ist in vielen Ländern nicht erlaubt. Einer der Hauptgründe hierfür ist die Tatsache, dass die momentan verfügbaren Totimpfstoffe meist keine Basis für einen DIVA-Impfstoff darstellen und auch nicht in der Lage sind, einen ausreichenden Schutz und eine sterile Immunität zu bewirken. Trotz neuester Entwicklungen auf den Gebieten der rekombinanten Vektoren und DNA-basierenden Vakzinen gegen AIV besteht immer noch die Notwendigkeit zur Entwicklung eines geeigneten Impfstoffs. Ziel sollte es sein, einen AIV-Impfstoff zu entwickeln, der einen Schutz gegen AIV beim Geflügel induziert, die Virusausscheidung verhindert oder zumindest reduziert und zudem eine Basis für einen DIVA-Impstoff bietet. Rekombinante Vektorvakzinen, welche auf der Grundlage eines nicht-übertragbaren Virus der vesikulären Stomatitis (VSV) hergestellt wurden, scheinen vor diesem Hintergrund ein vielversprechender Ansatz zu sein. Es wurden „single-cycle” VSV-Replikons hergestellt, welche entweder das HA-, NP-, M1- oder M2-Antigen des hochpathogenen aviären Influenzavirus Stamm A/ck/Rostock/34 (H7N1) exprimierten. Das Matrix Protein des VSV enthielt mehrere Mutationen, die dazu führten, dass der virale Vektor nicht-zytopathogen war. Nach Infektion von nicht-komplementierenden Zellen mit VSV-Replikons, welche das AIV HA-Antigen exprimierten, konnte keine Produktion von Tochterviren beobachtet werden, weswegen der Vektor als Biosicherheitslevel 1 Organismus („sicher“) eingestuft wurde. Es wurde gezeigt, dass diese Vektoren nicht replikationsfähig sind, weswegen sie auf einer Helferzelllinie (BHK-G43) vermehrt wurden, welche in trans das Glykoprotein von VSV (VSV-G) bereitstellte. Spezifische Pathogen freie Hühner (SPF-Hühner) wurden intramuskulär mit zytopathogenen Vektoren welche entweder das HA- oder das NP-Antigen exprimierten vakziniert. Nach 14 Tagen konnte eine humorale Immunantwort detektiert werden. HA- oder NP-Antikörper wurden in Serum, Tränenflüssigkeit, Tracheal- und Darmspülungen nachgewiesen. Eine Booster-Vakzinierung mit demselben Replikon führte zu einem signifikanten Anstieg der Antikörpertiter dieser Tiere. Wurden diese Hühner mit einer lethalen Dosis (107 EID50) des hochpathogenen, heterologen AIV (A/ck/Italy/445/99 (H7N1)) belastet, waren sie vor Erkrankung und Tod geschützt. Vektor-vakzinierte Hühner zeigten eine signifikante Reduktion bei der Ausscheidung des Belastungsvirus. Außerdem waren ihre Organe frei von AIV-Antigenen. Aufgrund der Tatsache, dass VSV polarisierte Epithelien nur in einem sehr geringen Maß infizieren kann, waren oral, intranasal oder ocular verabreichte VSV-Replikons nicht in der Lage, eine signifikante Immunantwort in Hühnern hervorzurufen. Pseudotypisierung der VSV-Replikons mit einem Baculovirus Glykoprotein (gp64) konnte die mukosale Applikation des Vektors nicht verbessern. Es konnte beobachtet werden, dass nicht-zytopathogene VSV-Replikons weniger Apoptose hervorriefen und Interferon (IFN) induzierten, was wiederum zu einer Abschwächung der Infektion und Expression der AIV-Antigene in vivo führte. Hühner, welche mit nicht-zytopathogenen VSV-Replikons vakziniert worden waren, zeigten keine signifikante humorale Immunantwort. Um dem Effekt der IFN-Induktion entgegenzuwirken, wurde das Gen für das E3L-Protein des Vaccinia Virus in den nicht-zytopathogenen Vektor eingesetzt, welcher außerdem das HA des HPAIV exprimierte. Durch die Insertion des IFN-Antagonisten in den VSV-Vektor waren Hühner, welche mit diesem Vektor inokuliert worden waren in der Lage, eine humorale Immunantwort zu bilden, die mit der von Hühnern, welche mit dem zytopathogenen Vektor immunisiert worden waren, vergleichbar war. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine in-ovo Vakzinierung mit nicht-übertragbaren VSV-Replikons, die das HA von AIV exprimieren sicher und effektiv ist. Auch nach oraler, intranasaler, und intramuskulärer Verabreichung wurden keine abweichenden Effekte beobachtet. Durch die Möglichkeit, kommerzielle ELISA Systeme zur Detektion von anti-NA und anti-NP Antikörpern einzusetzen, kann die DIVA-Strategie erfolgreich beim Einsatz der VSV-HA Replikons angewendet werden.

 

abstract (englisch)

Avian influenza viruses (AIV) pose a permanent threat to poultry and some strains have a strong zoonotic potential. General vaccination is not allowed for controlling AIV infections in poultry in many countries. Currently available inactivated vaccines do not often provide the basis for DIVA, and fail to provide sufficient protection and sterile immunity. Despite the recent developments in recombinant vector and DNA based vaccines against AIV, there is still need for a vaccine candidate which can prevent AIV infections in poultry and provide the basis for DIVA. In this regard, a recombinant vector vaccine based on non-transmissible vesicular stomatitis virus (VSV) may be promising AIV vaccine candidate. In this study, single-cycle VSV replicons were generated, which expressed either HA, NP, M1 or M2 antigen of highly pathogenic avian influenza A/FPV/Rostock/34 (H7N1). Mutations in the matrix protein of VSV rendered the viral vector non-cytopathogenic; therefore, the AIV antigens were simultaneously cloned into non-cytopathogenic VSV (VSVncp) vectors. Since no progeny virus was produced after infection of non-complementing cells with VSV replicons expressing HA, the vector was classified as biosafety level 1 organism (“safe”). As these viruses were non-transmissible therefore; they were propagated on helper cell line (BHK-G43), which provided VSV-G in trans. When specific pathogen free (SPF) chickens were intramuscularly vaccinated with the VSV cytopathogenic vector expressing either HA or NP antigens, they generated a substantial humoral immune response. Anti-HA and anti-NP antibodies were detected in sera, lacrimal fluids, tracheal washings and gut lavages of vaccinated birds. Booster vaccination with the same replicons resulted in a significant increase in the HA and NP antibody titres of birds. When these birds were challenged with a lethal dose (107 EID50) of highly pathogenic heterologous AIV (A/ck/Italy/445/99 (H7N1)), they were protected from disease and death. Vaccinated birds showed a significant reduction in the shedding of challenge virus and their organs were free from challenge virus antigen at three weeks post challenge. Owing to the fact that VSV hardly infects polarised epithelium, oral, intranasal, or ocular application of these VSV replicons failed to generate a significant immune response in chickens. Moreover, pseudotyping of these vectors with glycoprotein of baculovirus (gp64) could not improve the mucosal application of the vector. Non-cytopathogenic VSV replicons were found to be less apoptotic and induced interferon (IFN), which attenuated their infection and expression in-vivo. Birds vaccinated with non-cytopathogenic VSV replicons failed to show a significant humoral immune response. In order to counter the IFN effect, E3L of vaccinia virus was introduced into the non-cytopathogenic vector expressing HA of HPAIV. Due to the introduction of the IFN antagonist into VSV vectors, inoculated birds generated immune responses comparable with those of birds immunised with the cytopathogenic vector. Furthermore, in-ovo vaccination with non-transmissible VSV replicons expressing HA of HPAIV was found to be safe and effective. No adverse effects were observed when the vector-vaccines were applied either in-ovo, orally, intranasally, ocularly, or intramuscularly. The DIVA strategy was applicable for the HA and NP antigen expressing VSV vector vaccines, on the basis of commercially available NA- or NP-ELISAs.

keywords

VSV, aviäre Influenza, Impfstoffe; VSV, avian influenza, vaccines

kb

18.487