HABILITATIONSSCHRIFT

 


Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – University of Veterinary Medicine Hannover – Foundation / Library

 

Kristina Kadlec

 

Neue und ungewöhnliche antimikrobielle Resistenzgene bei Staphylokokken, ihr Vorkommen und ihre Mobilität

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-h2901

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Habilitationsschrift, 201X

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/h_kadlec18.pdf

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurden Staphylokokken-Isolate charakterisiert und auf ihre Resistenzeigenschaften untersucht. Insbesondere livestock-associated Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (la-MRSA) spielen eine große Rolle und wurden eingehend betrachtet.

Im Rahmen dieser Studie wurden neue und ungewöhnliche Resistenzgene in Staphylokokken identifiziert und inklusive ihrer flankierenden Regionen sequenziert. Ihre Transferabilität wurde untersucht, und teilweise wurden sogar die kompletten mobilen genetischen Elemente (MGEs) sequenziert. Nachweissysteme für die Gene und die MGEs wurden etabliert und publiziert. Außerdem wurden Kollektive von Staphylokokken mithilfe von molekularen Methoden eingehend charakterisiert und auf ihre Resistenzeigenschaften untersucht.

(1) Das erste Ziel der Studie war neue und ungewöhnliche Resistenzgene zu finden. Ein neues Trimethoprimresistenzgen dfrK wurde in la-MRSA Isolaten (Publikation 1, Publikation 2, Publikation 3, Publikation 4, Publikation 8, Publikation 9), einem MSSA ST398 Isolat (Publikation 5) und in einem Staphylococcus hyicus Isolat (Publikation 7) gefunden. Das Gen dfrK lag häufig in unmittelbarer genetischer Umgebung von einem bei Staphylokokken seltenen Tetrazyklin-Resistenzgen tet(L) (Publikation 1, Publikation 2, Publikation 3, Publikation 4, Publikation 8, Publikation 9). Das Linkosamid-/Pleuromutilin-/Streptogramin A-Resistenzgen vga(C) wurde ebenfalls erstmalig nachgewiesen (Publikation 2, Publikation 6). Das Makrolid-/Linkosamid-/Streptogramin B-Resistenzgen erm(T) wurde erstmalig in la-MRSA beschrieben (Publikation 4). Das neue Apramycinresistenzgen apmA wurde in einem la-MRSA identifiziert (Publikation 7).

(2) Das zweite Ziel der Arbeit war der Nachweis der Lokalisation von solchen Resistenzgenen, insbesondere in Hinblick auf MGEs. Alle erwähnten Gene lagen auf Plasmiden lokalisiert vor. Das Trimethoprim-Resistenzgen dfrK wurde aber auch auf einem chromosomal integrierten neuen Tranposon Tn559 gefunden (Publikation 5). Es zeigte sich, dass tet(L) immer gleich in unmittelbarer Umgebung zu dfrK auf Plasmiden lag (Publikation 1, Publikation 2, Publikation 4). Die tet(L)-dfrK-tragenden Plasmide umfassten alle Größen. Neben der Lokalisation auf einem kleinen Plasmid von 6.242bp, lag dieses Resistenzgencluster auch auf größeren Plasmiden von 14.362bp bis zu ca. 40kb. Alle größeren Plasmide trugen zusätzliche Resistenzgene und vermittelten somit Multiresistenz. Im Gegensatz dazu wurde dfrK auch alleinig auf einem kleinen Plasmid von 4.957bp in Staphylococcus hyicus vorgefunden (Publikation 7). Das Gen vga(C) wurde sowohl als einziges Resistenzgen auf einem kleinen Plasmid mit 5.292bp (Publikation 6) als auch auf dem 13.462bp großen Multiresistenzplasmid gefunden (Publikation 2). Das neue Apramycin-Resistenzgen apmA wurde auf einem kleinen Plasmid von 4.809bp gefunden (Publikation 7). Das kleine dfrK- und das kleine apmA-tragende Plasmid waren sich bis auf die Resistenzgenregion sehr ähnlich, unterschieden sich jedoch von bereits bekannten Plasmiden (Publikation7).

(3) Das dritte Ziel war, Nachweissysteme zu etablieren, die eine Detektion der neuen Gene und gegebenfalls der MGEs ermöglichen. Für alle neu identifizierten Gene wurden PCRs, die ein internes Fragment umfassen, entwickelt. Die identifizierten, neuen und ungewöhnlichen Resistenzgene wurden in den Microarray für S. aureus eingepflegt. Um das Gencluster tet(L)-dfrK nachzuweisen, wurde eine Kombi-PCR etabliert. Zur Detektion des Transposons Tn559 wurde ein PCR Assay publiziert, der die aktive zirkuläre Form des Transposons nachweist.  

(4) Das vierte Ziel stellte die Sequenzierung der flankierenden Regionen von Resistenzgenen, bestenfalls des gesamten MGEs, dar. Ein inverser PCR-Ansatz wurde entwickelt, mit dem sich die flankierenden Regionen aus dem dfrK-Gen im Transposon Tn559 heraus amplifizieren ließen. Das Transposon konnte gänzlich sequenziert werden. Die Plasmide wurde mithilfe von Klonierungsstrategien und/oder Primer-walking sequenziert. Von den in dieser Arbeit beschriebenen MGEs wurden bei zwei großen Plasmiden die Resistenzgen-Region sequenziert (Publikation 1, Publikation 4). Ein Multiresistenzplasmid wurde komplett sequenziert (Publikation 2). Die kleinen Plasmide wurden ebenfalls vollständig sequenziert (Publikation 6, Publikation 7). Alle Sequenzen wurden eingehend analysiert und in den Publikationen beschrieben sowie schematisch dargestellt.

(5)   Das fünfte Ziel war einen Einblick in die Verbreitung der identifizierten Resistenzgene durch die Untersuchung von Staphylokokken-Kollektionen auf deren Präsenz zu gewinnen. Dieses wurde durch die Untersuchung von la-MRSA von Schweinen und aus der Geflügelkette (Publikation 3, Publikation 8, Publikation 9) und im Zuge der Charakterisierung von Methicillin-resistenten Staphylococcus pseudintermedius (MRSP)-Isolaten erreicht (Publikation 10). Während die neuen und ungewöhnlichen Resistenzgene bei MRSP nicht vorkamen, wurden sie in la-MRSA Isolaten häufig nachgewiesen.

keywords

Staphylococcus, Antibiotikaresistenz, Plasmid ; staphylococcus, antimicrobial resistance, plasmid

kb

1.420