Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (TiHo)

Molekulargenetische Untersuchungen zum Nitratstoffwechsel und diagnostischen Nachweis von Mykobakterien

Ackermann, Birgit

Viele Mykobakterien besitzen die Fähigkeit, Nitrat zu Ammonium zu reduzieren, welches als alternative Stickstoffquelle genutzt werden kann und somit zur Assimilation dient. Es ist jedoch nicht bekannt, durch welche Gene diese Eigenschaft exprimiert wird und welche Aufgabe sie genau erfüllt. Im Zuge der in dieser Arbeit dargestellten und diskutierten Untersuchungen ist es gelungen, mit Hilfe von Klonierungsexperimenten einen einzelnen Abschnitt aus dem Genom von M. tuberculosis zu isolieren. Dieser ORF Rv 0818 zeigte bei der Analyse seiner Sequenz eine sehr hohe Homologie zu dem glnR-Gen von Streptomyces coelicolor und entspricht vermutlich dem Regulator GlnR, der die Glutaminsynthetase positiv reguliert. Diese Glutaminsynthetase reguliert wiederum die Gene für die Nitratassimilation positiv. Weiterhin wurde mit Hilfe der Lightcycler-Technologie versucht, eine PCR zur schnellen „Online“-Diagnostik von Mykobakterien zu entwickeln. Der Lightcycler ermöglicht mit seiner Software und der kontinuierlichen Messung von Fluoreszenzsignalen, die in Form einer Schmelzkurvenanalyse ausgewertet werden können, eine besonders schnelle und zuverlässige Detektion von spezifisch amplifizierten Produkten. Es wurden ein 1000 bp-großes genusspezifisches oder ein 300 bp-großes speziesspezifisches Fragment des mykobakteriellen 16S rRNA-Gens amplifiziert. Das 16S rRNA-Gen ist besonders gut geeignet, da auf ihm sowohl genusspezifische als auch speziesspezifische Bereiche hoch konserviert sind, so dass eine Zuordnung bestimmter Sequenzen zu einer Art oder Spezies leicht möglich wird. Das 1000 bp-große Fragment wurde mit einem für den Genus „Mycobacterium“ spezifischen Primer- und zusätzlichen Sondenpaar zuerst amplifiziert und in derselben Reaktion auch hybridisiert. Dabei wurde zwar DNA von M. bovis BCG bis zu ca. drei Kopien zuverlässig detektiert, aber bei den anderen Mykobakterienspezies wurde nur eine wesentlich geringere Sensitivität erzielt. Die Spezifität der genusspezifischen Reaktion war mangelhaft, da auch mit Mykobakterien eng verwandte Arten, wie z.B. Nocardien, mitamplifiziert wurden. Die Spezifität der speziesspezifischen Reaktion dagegen war sehr gut, da weder mit Mykobakterien eng verwandte Arten noch andere Mykobakterienspezies von dem speziesspezifischen Primer- und Sondenpaar detektiert wurden. Lediglich DNA von M. bovis BCG wurde zuverlässig detektiert, allerdings nur mit einer Sensitivität zwischen ca. 30-300 Kopien. Insgesamt stellen die Versuche auf dem Lightcycler einen wichtigen Schritt zur Nutzung moderner Technologien dar, die eine viel schnellere Diagnose von Infektionskrankheiten auf molekularer Ebene erlauben.

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Ackermann, Birgit: Molekulargenetische Untersuchungen zum Nitratstoffwechsel und diagnostischen Nachweis von Mykobakterien. Hannover 2001. Tierärztliche Hochschule.

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