Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Enrica Zumnorde-Mertens

Der Einfluss von Trophoblastzell-Produkten auf die plazentare

Angiogenese des Rindes in vitro

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108829

title (engl.)

The influence of trophoblast cell products on placental angiogenesis of the bovine species in vitro

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/zumnorde-mertense_ss16.pdf

abstract (deutsch)

In der Trophoblastzellschicht der bovinen Plazenta enthaltene mehrkernige Trophoblastriesenzellen (TGC) besitzen im Gegensatz zu der Hauptpopulation einkerniger Trophoblastzellen nicht die typischen Epithelzelleigenschaften. Als nicht polarisierte Zellen migrieren sie in das maternale Kompartiment der Plazenta, wo sie mit Epithelzellen zu Hybridzellen verschmelzen. Dadurch gelangen intrazytoplasmatisch lokalisierte Substanzen aus dem fetalen in das maternale Kompartiment. Unter diesen Substanzen befinden sich neben weiteren, FGF und VEGF, deren pro-angiogene Wirkung allgemein bekannt ist. So gelang es bei Mensch und Maus nicht nur, diese pro-angiogenen Substanzen in plazentaren Gefäßen und in TGC zu lokalisieren, sondern auch eine Regulation der plazentaren Angiogenese durch TGC-Produkte nachzuweisen. Auch für das Rind wird eine Beeinflussung der plazentaren Angiogenese durch Produkte der TGC angenommen.

Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit bovine Endothelzellen aus der Nabelvene (BUVEC) mit Produkten der TGC stimuliert, um deren potentiell angiogenen Effekte zu analysieren. Dazu erfolgte zunächst die Primärisolation der BUVEC mittels einer enzymatischen und mechanischen Isolationsmethode. Im Anschluss daran wurde der endotheliale Charakter der isolierten Zellen durch deren Eigenschaft, acetyliertes Low Density Lipoprotein (Dil-ac-LDL) aufzunehmen, bestätigt. Nachfolgend wurden biologischen Wirkungen der TGC-Produkte auf die Zellproliferation (MTT-Assay) und –motilität (Live Cell Imaging) als Teilaspekte des Angiogenese-Prozesses untersucht. Dazu fanden FGF 1, 2, 4, 7, IGF 1 und 2, EGF, bPL und die Kombinationen aus IGF1 und EGF sowie IGF2 und EGF Verwendung. In einem weiteren Versuchsabschnitt der vorliegenden Arbeit wurde mittels Real-Time PCR die Expression von SN 1, 2, 3, 4, Heparanase, Endothelin 1, Endothelin-Converting Enzyme 1, MMP 1, 2, 9, 13, 14, TIMP 1 und 2 sowie EMP nach Stimulation der BUVEC mit FGF1, 2 und 4 untersucht. In einem dritten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde für BUVEC ein in vitro Angiogenese-Assay etabliert, um die Effekte der TGC-Produkte auf die Formation gefäßähnlicher Strukturen zu untersuchen. Dazu wurden im Rahmen des Venous Ring Sprouting Assays Gefäßringe der fetalen Nabelvenen in eine drei-dimensionale Matrix (Gele aus Kollagen I) eingebracht und mit FGF1, 2, VEGF, IGF1, 2, bPL, EGF und Kotyledonen-konditioniertem Medium (KKM) stimuliert. Auch erfolgte die Bildung von Kokultursphäroiden aus BUVEC und plazentaren Fibroblasten, die in Kollagengele eingebettet und mit der Kombination aus FGF2 und IGF1 sowie bPL stimuliert wurden. Zudem fungierten in einem weiteren Angiogenese-Assay Microcarrier als Träger für BUVEC. Nach der Einbettung in Kollagengele erfolgte die Stimulation mit FGF2, VEGF, bPL und IGF1.

Durch die Aufnahme von Dil-ac-LDL war es möglich, die isolierten Zellen sicher als BUVEC zu identifizieren. Eine signifikant gesteigerte Zellproliferation wurde nach Stimulation mit FGF1 (1,6-fach), FGF2 (1,8-fach) und FGF4 (1,6-fach) erreicht. Die Zellmotilität wurde durch keines der eingesetzten TGC-Produkte beeinflusst. Im Rahmen des Venous Ring Sprouting Assays wurde eine signifikant vergrößerte Fläche der ausgewachsenen Zellen lediglich durch die Behandlung mit Endothelzellvollmedium (EVM) erreicht, welches als Positivkontrolle während des Versuches diente. FGF2 zeigte die Tendenz (p= 0,065), zu einer vergrößerten Fläche der ausgewachsenen Zellen zu führen. Die Kokultursphäroide wiesen in Bezug auf die ausgewachsenen Zellen, unabhängig vom eingesetzten Stimulanz, keinen optischen Unterschied zu reinen Fibroblastensphäroiden auf, die während des Versuches als Negativkontrolle dienten. Eine Formation gefäßähnlicher Strukturen wurde im Microcarrier-basierten Sprouting Assay ausschließlich durch die Stimulation mit FGF2 erzielt (1,2-fach signifikant gesteigert gegenüber der Positivkontrolle EVM). Eine signifikant gesteigerte mRNA-Expression von MMP1 wurde durch EVM (1,71-fach), welches als Positivkontrolle diente, erzielt, wohingegen die eingesetzten FGF keine Veränderungen auf mRNA-Ebene hervorriefen. Die Expression von MMP14 wurde durch FGF1 (1,80-fach), FGF2 (1,70-fach) und FGF4 (1,90-fach) signifikant gesteigert. Für SN1 wurde eine signifikant gesteigerte Expression auf m-RNA Ebene durch die Behandlung mit EVM (2,72-fach) und der Stimulation mit FGF2 (2,41) festgestellt.

In Rahmen dieser Arbeit wurde die mechanische Isolation der BUVEC mittels Schabetechnik etabliert, durch die, im Vergleich zur enzymatischen Isolation, eine Reduktion von Kontaminationen der primären Zellkultur erreicht werden konnte. Zusätzlich empfahl sich der Microcarrier-basierte Sprouting Assay als ein für BUVEC geeigneter in vitro Angiogenese-Assay.

In der vorliegenden Arbeit gelang es, TGC-Produkte zu identifizieren, die in vitro die plazentare Angiogenese beziehungsweise Teilschritte dieses Prozesses beeinflussen. Zu diesen TGC-Produkten gehören die FGF, die nicht nur die BUVEC Proliferation signifikant steigern, sondern auch das Expressionsprofil von Genen, die während des Angiogenese-Prozesses von Bedeutung sind, in BUVEC verändern. Weitergehend bestätigt wurde die pro-angiogene Wirksamkeit von FGF2 durch die Tatsache, dass dieser Faktor in vitro die Bildung gefäßähnlicher Strukturen hervorruft. Da ähnliche Effekte für FGF2 in Bezug auf die plazentare Angiogenese des Rindes auch in vivo anzunehmen sind, ist eine Beeinflussung dieses Prozesses durch Produkte des Trophoblasten als wahrscheinlich anzusehen. Dennoch bedarf es zusätzlicher Forschungsarbeit, um diese Hypothese weitergehend zu bestätigen und die Funktion weiterer TGC-Produkte während der plazentaren Angiogenese zu analysieren.

 

abstract (englisch)

The trophoblast cell layer of the bovine placenta contains trophoblast giant cells (TGC) with generally two nuclei, which in contrast to the main population of uninuclear trophoblast cells do not show the typical characteristics of epithelial cells. As non-polarized cells they migrate towards the maternal part of the placenta where they form syncytia together with epithelial cells. Thereby intracytoplasmatically located substances are transported from the fetal into the maternal compartment of the placenta. Among these substances FGF and VEGF can be found. Their angiogenic potential is well known. In the human and murine placenta these substances were not only detected close to blood vessels and in TGC, but also a regulation of placental angiogenesis by products of TGC was shown. For the bovine species the influence of TGC products on placental angiogenesis is assumed, too.

Therefore, in the present study endothelial cells from the bovine umbilical vein (BUVEC) were isolated and consecutively stimulated with trophoblast cell products in order to investigate their angiogenic potential. To fulfill this aim, a primary isolation of BUVEC was conducted using an enzymatic as well as a mechanical isolation method. Subsequently, the endothelial character of the isolated cells was confirmed by low density lipoprotein (Dil-ac-LDL) uptake. The potential of TGC products to influence BUVEC proliferation (MTT-assay) and motility (live cell imaging), as parts of the angiogenesis process, was investigated in the following. TGC products used were FGF 1, 2, 4, 7, IGF 1 and 2 EGF, bPL and the combinations of IGF1 and EGF as well as IGF2 and EGF. In another part of the present study BUVEC mRNA expression profiles of SN 1, 2, 3, 4, heparanase, endothelin 1, endothelin-converting enzyme 1, MMP 1, 2, 9, 13, 14, TIMP 1 and 2 as well as EMP were determined using real-time PCR after stimulation with FGF1, 2 and 4. In the study’s third part an in vitro angiogenesis assay for BUVEC was established and conducted. For this purpose rings of the fetal bovine umbilical vein were embedded in collagen gels, serving as a three dimensional matrix (venous ring sprouting assay) and stimulated with FGF1, 2, VEGF, IGF1, 2, bPL, EGF, and cotyledon-conditioned medium. In addition to that, co-culture spheroids were formed using BUVEC and placental fibroblasts. After embedding them in collagen gels, they were stimulated with a combination of FGF2 and IGF1 as well as bPL. A third angiogenesis assay was carried out where BUVEC were grown on microcarriers, embedded in collagen gels and treated with FGF2, VEGF, bPL and IGF1.

Through the uptake of Dil-ac-LDL the isolated cells were securely identified as BUVEC. A significant increase in BUVEC proliferation was reached by the stimulation with FGF1 (1,6times), 2 (1,8times) and 4 (1,6times). BUVEC motility was not increased by any of the TGC products. Using the venous ring sprouting assay, only the treatment with complete endothelial cell medium (CEM) led to a significantly increased area of outgrowing cells, while FGF2 showed a tendency (p=0,065) towards an increased area of outgrowing cells. Co-culture spheroids showed no optical difference concerning the outgrowing cells compared to pure placental fibroblast spheroids (negative control). A significant formation of capillary structures was reached by the treatment with FGF2 utilizing the microcarrier-based sprouting assay (1,2times compared to CEM, serving as a positive control). The gene expression profile of MMP1 mRNA was upregulated significantly through the treatment with CEM (1,71times), being a positive control, whereas FGF did not show effects. MMP14 mRNA expression was increased by FGF1 (1,80times), FGF2 (1,70times), and FGF4 (1,90times) in a significant manner. Expression of SN1 mRNA was significantly raised by CEM (2,72times) and FGF2 (2,41times).

In this study a mechanic isolation method for BUVEC was established which led to reduced contamination of the cell cultures in comparison to the enzymatic isolation method. For BUVEC the microcarrier-based sprouting assay turned out to be a well working in vitro angiogenesis assay.

TGC products were identified which have an influence on placental angiogenesis or at least parts of the process in the present study. Among these was FGF which did not only stimulate BUVEC proliferation significantly but also upregulated expression profiles of genes that are involved in the process of angiogenesis. Furthermore, the angiogenic potential of FGF2 was confirmed by its ability to generate the outgrowth of sprouts. As similar effects of FGF2 can be expected in vivo, too, it is likely that TGC products have a regulatory influence on placental angiogenesis. However, further research work is needed to confirm this hypothesis. In addition to that, the influence of other TGC products on placental angiogenesis has to be investigated.

 

keywords

Bovine Plazenta, Trophoblastzell-Produkte, Angiogenese, Bovine placenta, trophoblast cell products, angiogenesis

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