Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Elke Vera Ziegler

 

Pharmacological investigations on inhibitory ligand-gated ion channels

using patch clamp technique in combination with an ultra-fast perfusion system

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-97358

title (ger.)

Pharmakologische Untersuchungen an inhibitorischen liganden-aktivierten Ionenkanälen unter Verwendung der Patch Clamp Technik in Kombination mit einem ultraschnellen Perfusionssystem

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2009

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/zieglere_ss09.pdf

abstract (deutsch)

GABAA und Glyzin Rezeptoren, inhibitorisch wirkende Liganden-aktivierte Ionenkanäle, zeigen viele strukturelle Übereinstimmungen auf, dennoch weisen sie physiologische als auch pharmakologische Unterscheide auf. Die Aktivierung des GABAA Rezeptors wird allosterisch von verschiedenen Substanzen beeinflusst. Dazu gehören Neurosteroide, aber auch die therapeutisch eingesetzten Barbiturate und Benzodiazepine. Diese Substanzen binden an GABAA und Glyzin Rezeptoren, was zu reduzierter neuronaler Erregbarkeit im Zentralnervensystem führen kann. Bis jetzt sind GABAA Rezeptoren weitaus genauer untersucht als Glyzin Rezeptoren. Die Bindung von Anästhetika und krampflösenden Mitteln an den GABAA Rezeptor wurde in etlichen Mutagenese-Studien mit dem zweiten und dritten transmembranären Bereich des GABAA Rezeptors in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit wurde eine Punktmutation im dritten transmembranären Bereich der a1 Untereinheit des a1b2g2 GABAA Rezeptors elektrophysiologisch genauer charakterisiert. Bei dieser Punktmutation handelt es sich um den Austausch eines Cytosins durch ein Adenosin, wodurch in der Translation Alanin durch Aspartat substituiert wird. Diese Mutation wird mit einer Form der idiopathischen generalisierten Epilepsie, der juvenilen myoklonischen Epilepsie, in Verbindung gebracht. Pharmakologische Untersuchungen am a1-A322Db2g2 GABAA Rezeptor zeigten weder veränderte agonistische, potenzierende noch Block-Effekte beim Einsatz des hypnotisch, sedativ wirkenden Barbiturates, Phenobarbital. Bicucullin, ein kompetitiver Agonist am GABAA Rezeptor, zeigte jedoch eine geringere Affinität zum a1-A322Db2g2 GABAA Rezeptor. Picrotoxin, ein nicht kompetitiver Agonist des GABAA Rezeptors, der innerhalb des Chlorid-Ionen Kanals bindet, wies durch die Mutation keine veränderte Bindungsaffinität auf. Des Weiteren haben wir die molekularen Mechanismen der agonistischen und potenzierenden Effekte von Androsteron und Progesteron an a1b2g2 GABAA, a1 Glyzin und a1b Glyzin Rezeptoren elektrophysiologisch genauer untersucht. Androsteron wurde bereits eine potenzierende Wirkung am GABAA bzw. Glyzin Rezeptor zugeschrieben. In dieser Arbeit konnte aufgezeigt werden, dass die Sensitivität des Rezeptors bei co-agonistischer Bindung von Androsteron von der homomeren und heteromeren Struktur des Glyzin Rezeptors abhängig ist. Des Weiteren konnten wir einen agonistischen Effekt von Androsteron am GABAA Rezeptor aufzeigen. In bereits erschienenen Veröffentlichungen wurden rekombinante Glyzin Rezeptoren durch Progesteron inhibiert. Jedoch zeigt diese Arbeit, dass Progesteron eine potenzierende Wirkung am Glyzin Rezeptor haben kann, wenn die Patch Clamp Technik in Verbindung mit der schnellen Applikation verwendet wird. Beide untersuchten neuroaktiven Steroide beeinflussen GABA- und Glyzin- induzierte Ströme positiv, aber scheinen bei Konzentrationen von 0.1 mM und höher inhibitorisch zu wirken.

 

abstract (englisch)

GABAA and glycine receptors, inhibitory ligand-gated ion channels, show functional homology but have specific differences in their physiology and pharmacology. The activity of GABAA receptors can be allosterically modulated by a number of agents, including neurosteroids and the clinically important barbiturates and benzodiazepines. These agents act on GABAA and glycine receptors to reduce neuronal excitability in the central nervous system. However, glycine receptors are not investigated as detailed as GABAA receptors. Several mutagenesis studies have implicated residues in the second and third transmembrane domain in the action of anaesthetics and anticonvulsant drugs on the GABAA receptor. We report here, that the mutation, alanine (322) to aspartic acid in the third transmembrane domain of the a1 subunit of a1b2g2 GABAA receptor did neither affect the agonistic, potentiating or blocking effect of phenobarbital. However, examination of the competitive antagonist bicuculline revealed a reduced binding to the mutant GABAA receptor. Investigations of the non-competitive antagonist picrotoxin binding within the channel pore showed no altered binding on mutant GABAA receptor. Additionally, we examined the molecular mechanism of the agonistic and potentiating action of androsterone and progesterone on wild type a1b2g2 GABAA, homomeric a1 glycine and heteromeric a1b glycine receptors. Androsterone is known to increase the inward currents induced by GABA and glycine. We could show that association of b subunits with a subunits affects the sensitivity of glycine receptors to androsterone. Furthermore, we showed an agonistic effect of androsterone on GABAA receptor channels. In contrast to previous reports in which recombinant glycine receptors were inhibited by progesterone, a potentiating effect was revealed by our experiments using the fast application technique. Both steroids tested are positive modulators of GABA and glycine responses but seem to have inhibitory effects on a1b2g2 GABAA and a1 glycine receptor channels at concentrations of 0.1 mM and higher. In conclusion, the GABA binding site and closely related gating steps are functionally affected by the A322D mutation in the a1-subunit of the GABAA receptor but not the phenobarbital binding site and the channel pore. Further investigations using the neurosteroids progesterone and androsterone showed that the GABAA receptor seems to be an indirect specific nonclassical steroid receptor and the glycine receptor a nonspecific nonclassical steroid receptor.

 

keywords

inhibitorische Ionenkanäle, Patch Clamp Technik, Neurosteroide; inhibitory ion channels, patch clamp technique, neurosteroids

kb

3.186