Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Nathalie Zeitouni

The role of hypoxia in the intestinal epithelial cell response to Yersinia enterocolitica

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107801

title (ger.)

Die Rolle von Hypoxie in der intestinal-epithelialen Zellantwort gegen Yersinia enterocolitica

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/zeitounin_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Hypoxie, ein Zustand von Sauerstoff-Mangel bei dem Sauerstoffkonzentrationen unter das normoxische atmosphärische Niveau fallen, hat signifikante Auswirkungen auf etliche zelluläre Prozesse und beeinflusst die Pathogenese von verschiedenen Krankheiten. Innerhalb des menschlichen Körpers werden die Gewebe mit verschiedensten Sauerstoffkonzentrationen versorgt, welche unter dem atmosphärischen Niveau liegen, jedoch biologisch ausreichend bleiben; daraus resultiert ein Zustand, der Physioxie genannt wird.

Im  gastrointestinalen Trakt gibt es einen steilen Sauerstoffgradienten, wobei die physioxischen Konzentrationen im intestinalen Epithelium zwischen 1% und 7% liegen können. Um ein intestinal-epitheliales in vitro Zell-Modell zu etablieren, ist es von entscheidender Bedeutung die Sauerstoff-konzentrationen in der Zellkultur zu bestimmen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Sauerstoffkonzentrationen in drei verschiedenen Caco-2 Zellkultursystemen unter der Verwendung von optischen Sensoren untersucht; in konventionellen 24-Wellplatten aus Polystyren, in speziellen Gas-permeablen 24-Wellplatten sowie mit Membraneinsätzen. Alle Zellkultursysteme zeigten niedrigere Sauerstoffkonzentration als erwartet, wenn sie unter normoxischen Bedingungen über sechs Tage kultiviert wurden. Dabei wiesen die konventionellen 24-Wellplatten Konzentrationen von weniger als 3% auf, während die Konzentrationen sowohl in den Gas-permeablen Platten als auch in den Membraneinsätzen bei über 13% lagen. Eine Inkubation der verschiedenen Zellkulturen unter hypoxischen Bedingungen (1% Sauerstoff) führte zu einer raschen Angleichung an Umgebungssauerstoffkonzentrationen in den Gas-permeablen als auch den konventionellen 24-Wellplatten, jedoch nicht in den Membraneinsätzen, welche auch nach 6 Stunden Werte von knapp 3% aufwiesen.

Studien haben gezeigt, dass die zelluläre Hypoxie zu einer Anreicherung des „hypoxia-inducible factor“, HIF1α führt; dieses Protein wirkt als eine Art globaler Regler bei der zellulären Anpassung an sauerstoff-bedingten Stress. Um dies näher zu betrachten, wurden mit Hilfe von Western Blot Analysen die Proteinkonzentrationen von HIF1α in den verschiedenen oben beschriebenen Zellkultursystemen bestimmt. Unter hypoxischen Bedingungen wurde bereits nach einer Stunde eine deutliche Stabilisierung des HIF1α Proteins in Caco-2 Zellen in denkonventionellen 24-Wellplatten, sowie den Gas-permeablen Platten festgestellt, in den Membraneinsätzen erst nach 4 Stunden. Daraus folgernd wurde empfohlen, dass bei der Durchführung von Sauerstoff-abhängigen Versuchen sowohl das Zellkultursystem als auch die Bedingungen näher in Betracht gezogen werden sollten.

Des Weiteren wurde Hypoxie bei Entzündungen und Infektionen im Gewebe überwiegend auf Grund von verminderter Verfügbarkeit von Sauerstoff oder erhöhtem Verbrauch von Sauerstoff durch einwandernde Pathogene oder rekrutierte Immunzellen beschrieben. Wenn bakterielle Infektionen im gastrointestinalen Trakt untersucht werden, ist es daher von großer Bedeutung, die zellulären Prozesse unter niedrigen Sauerstoffkonzentrationen sowie ihre Auswirkung auf die Wirt-Erreger-zu berücksichtigen. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Wechselwirkung zwischen dem gastrointestinalen zoonotischen Bakterium Yersinia enterocolitca und intestinalen Epithelzellen unter hypoxischen Bedingungen. Es wurde gezeigt, dass eine hypoxische Vorinkubation der Caco-2 Zellen zu einer signifikant reduzierten Internalisierung der Bakterien führte. Dieser Phänotyp wurde durch die funktionelle Blockade von β1 Integrin der Wirtszellen sowie durch Infektion mit einem Invasin-defizienten Y. enterocolitica Stamm aufgehoben. Verminderte Proteinkonzentrationen von β1 Integrin in Zellen, welche unter Hypoxie kultiviert wurden, bestätigten diese Ergebnisse. Schlussendlich wurde eine potentielle Rolle von HIF1α vorgeschlagen, da die Behandlung mit dem HIF1α Agonisten Dimethyloxalylglycine zu einer verminderten Internalisierung von Y. enterocolitica sowie zu reduzierten β1 Integrin Proteinkonzentrationen führte.

Diese Arbeit hebt die Relevanz von Hypoxie im Zusammenhang mit gastrointestinalen Infektionen hervor und erörtert die Rolle von HIF1α als potentiell therapeutischen Wirkstoff.

abstract (englisch)

Hypoxia, a state of oxygen deficiency that occurs when oxygen concentrations fall below the normoxic atmospheric levels, has a significant effect on several cellular processes and has been shown to influence the pathogenesis of several diseases. Within the human body however, tissues are supplied with different oxygen concentrations that are below atmospheric levels but that remain biologically sufficient, thus resulting in a state termed physioxia. The gastrointestinal tract has been shown to experience a steep oxygen gradient, resulting in physioxic levels ranging between 1% and 7% in the intestinal epithelium. Therefore, when trying to establish an in vitro intestinal epithelial cell model, it is critical to properly characterize the oxygen conditions found in the cell culture.  This study aimed to measuring oxygen levels in three different systems of Caco-2 cell culture, conventional polystyrene 24-well plates, special 24-well gas permeable plates and membrane inserts, using optical sensor spots. All culture systems displayed lower O2 levels than expected when cultured under normoxic conditions over the course of six days, with conventional 24 well plates reaching as low as 3% oxygen while remaining above 13% in gas permeable plates and membrane inserts. Incubation of the different cultures under hypoxic conditions (1%) resulted in a rapid equilibration to the environmental oxygen levels in the gas permeable and conventional 24 well plates, but not in the membrane inserts that remained at 3% after 6 hours. Studies have shown that cellular hypoxia results in the accumulation of the hypoxia-inducible factor, HIF-1α, that acts a global regulator of cellular adaptation to oxygen stress. Therefore, Western blot analysis was used to determine the protein levels of HIF-1α in the different cultures, revealing a distinct stabilization of HIF-1α protein after only 1 hour of hypoxic incubation of Caco-2 cultures in conventional 24-well and gas permeable plates, and after 4 hours in membrane inserts. Therefore, we suggest that the culture system and conditions should be taken into consideration when performing oxygen-dependent experiments.

Furthermore, hypoxia has been shown to occur in tissues at sites of inflammation and infection, mainly because of decreased oxygen diffusion, and increased consumption by invading pathogens and recruited immune cells. When studying bacterial infections in the gastrointestinal tract, it is important to take into account the cellular responses to low oxygen concentrations and their effect on host-pathogen interactions. This study investigates the interaction between the gastrointestinal zoonotic bacterium Yersinia enterocolitica and intestinal epithelial cells under hypoxic conditions. It was found that hypoxic pre-incubation of Caco-2 cells resulted in significantly decreased bacterial internalization, a phenotype that was abolished after functionally blocking host β1 integrins as well as upon infection with an invasin-deficient Y. enterocolitica strain. Decreased protein levels of β1 integrins in hypoxic incubated cells corroborated these results. Finally, a potential role for HIF-1α was hypothesized, since treatment with the HIF-1α agonist, dimethyloxalylglycine, also resulted in reduced Y. enterocolitica internalization and decreased β1 integrin protein levels.

The study highlights the relevance of hypoxia in the context of gastrointestinal infections and discusses a role for HIF-1α as a potential therapeutic agent.

keywords

Sauerstoff, Infektionen, Wirt-Pathogen-Interaktion; oxygen, infection, host-pathogen interaction

kb

1.569