Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Maximiliane Sophie Zangl

Influence of Viral Proteins and Cellular Exoribonuclease Xrn1 on

RNA Recombination in Pestiviruses

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107045

title (ger.)

Einfluss der viralen Proteine und der zellulären Exoribonuklease Xrn1 auf die RNA-Rekombination bei Pestiviren

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/zanglm_ss15.pdf

abstract (deutsch)

RNA Viren sind bekannt für ihre große genetische Variabilität, welche hauptsächlich auf die Akkumulation von Punktmutationen während der RNA-Synthese und verschiedene Arten von RNA-Rekombinationen zurückzuführen ist. Genetisches Material kann durch RNA-Rekombination ausgetauscht werden, wodurch letale oder nachteilige Mutationen eliminiert werden können. Dieser Prozess ist für das langfristige Überleben einer Viruspopulation von essenzieller Bedeutung. Zur Erforschung grundlegender Aspekte der viralen RNA-Rekombination ist das Bovine Virusdiarrhoe Virus (BVDV) gut geeignet, da es über einen nichtzytopathogenen (nzp) und einen zytopathogenen (zp) Biotyp verfügt. Des Weiteren stehen ein reverses genetisches System und ein auf Zellkultur basiertes RNA-Rekombinationssystem zur Verfügung.

Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit dem Einfluss der effizienten Translation viraler Proteine und der wirtseigenen 5’-3’ Exoribonuklease Xrn1 auf die RNA-Rekombination bei Pestiviren. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein RNA-Rekombinationssystem entwickelt, welches auf der Kotransfektion von MDBK-Zellen mit synthetischen replikationsinkompetenten viralen RNA-Fragmenten basiert. Dieses System ermöglichte RNA-Rekombination in der Abwesenheit von einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES)-vermittelten Translation der viralen Proteine. Durch die Detektion von über 70 unabhängig entstandenen rekombinanten Viren wurde belegt, dass virale RNA-Rekombination die effiziente Translation viraler Proteine nicht benötigt. Sequenzanalysen zeigten eine hohe Flexibilität bezüglich der Struktur des Kapsidproteins der entstandenen rekombinanten Viren auf. Zahlreiche rekombinante Viren ersetzten das parentale Kapsidprotein mit langen Fusionsproteinen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass kapsidprotein-kodierende Sequenzen funktional fehlende ubiquitin-codierende Sequenzen eines Ubiquitinmonomers ersetzen können, da dieses dennoch als Prozessierungssignal für zelluläre Proteasen diente. Manche der genetischen Veränderungen der rekombinanten Viren wirkten sich signifikant auf RNA-Synthese oder Virusmenge aus.

Der zweite Teil dieser Studie zeigt, dass die RNA-Rekombinationshäufigkeit eines Säugetier-Plus-Strang-RNA Virus signifikant anstieg, wenn die zelluläre 5’-3’ Exoribonuklease Xrn1 herunter reguliert wurde. Die Herunterregulierung von Xrn1 führte nicht nur bei der RNA-Rekombination zwischen zwei replikationsinkompetenten synthetischen RNA-Fragmenten zu einem Anstieg an Rekombinationsereignissen, sondern auch wenn die RNA-Rekombination zwischen einer synthetischen replikationsinkompetenten RNA und dem Genom eines replizierenden nzp-Virus stattfand. Das zuletzt genannte System spiegelt RNA-Rekombinationsereignisse im Wirtstier nach natürlicher Infektion besser wider. Des Weiteren wurde die transfizierte virale RNA in Zellen mit reduziertem Xrn1-Gehalt langsamer degradiert als im Kontrollansatz. Interessanterweise befanden sich die identifizierten Degradationsstellen hauptsächlich in einzelsträngigen Regionen der RNA. Quantitative Analysen der Mengen an akkumulierter viraler RNA und der viralen Titer nach Infektion ergaben keinen signifikanten Unterschied zwischen Zellen mit reduziertem Xrn1-Gehalt und Kontrollzellen. Zusammenfassend unterstützen die Beobachtungen dieser Studie die Hypothese, dass die Entstehung viraler Rekombinanten wahrscheinlich ein Ergebnis eines „breakage and ligation“ Mechanismus ist, welcher auf zellulären Prozessen unter Einbeziehung der wirtseigenen Ribonukleasen basiert.

abstract (englisch)

RNA viruses are known for their broad genetic diversity, which can mainly be attributed to the accumulation of point mutations during RNA synthesis and diverse kinds of RNA recombination. Genetic material can be exchanged by RNA recombination, thus it allows the elimination of lethal or debilitating mutations, which is required for long-term survival of a virus population. To study fundamental aspects of viral RNA recombination, Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a particularly suited model. It exhibits a noncytopathogenic (ncp) and a cytopathogenic (cp) biotype and provides the availability of reverse genetics together with a cell culture-based RNA recombination system.

The present study addresses the influence of efficient translation of viral proteins and the effect of the host 5’-3’ exoribonuclease Xrn1 on the RNA recombination in pestiviruses. In the first part, an RNA recombination system was established, which was based on the cotransfection of MDBK cells with two synthetic, nonreplicable viral RNA fragments, allowing RNA recombination in the absence of an internal ribosomal entry site (IRES)-mediated translation of viral protein. The detection of over 70 independently emerged recombinant viruses proofed that viral RNA recombination does not require the efficient translation of viral proteins. Sequence analysis demonstrated that the emerged recombinant viruses displayed a high flexibility with regard to the structure of C protein. Numerous recombinants replaced the parental C protein with large-scale fusion proteins. Furthermore, evidence was given that C coding sequences can functionally replace lacking ubiquitin coding sequences of one ubiquitin monomer, still serving as processing signal for cellular proteases. Some of the genomic alterations of the recombinant viruses influenced significantly the RNA synthesis or the virus yield.

The second part of this study revealed that the viral RNA recombination frequency of a mammalian plus strand RNA virus is significantly increased when knocking down the cellular 5’-3’ exoribonuclease Xrn1. Xrn1-knockdown resulted in a higher number of emerged recombinants not only when recombination occurred between two synthetic viral replication-incompetent RNA fragments, but also when recombination occurred between a synthetic replication-incompetent RNA and the genome of a replicating ncp virus. The latter system better reflects RNA recombination events in the host during natural infection. Furthermore, in Xrn1-knockdown cells the transfected viral RNA was more slowly degraded compared to control cells. Interestingly, identified degradation sites were mainly located in single-stranded regions. Quantitative analysis of viral RNA synthesis and yield of infectious virus produced after infection revealed no significant differences between Xrn1-knockdown cells and control cells. Therefore, the results of the present study support the hypothesis that the emergence of viral recombinants is presumably a result of a breakage and ligation mechanism based on cellular processes, including ribonucleases of host cells.

keywords

RNA-Rekombination, Pestiviren, Exoribonuklease Xrn1, RNA recombination, pestiviruses, exoribonuclease Xrn1

kb

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