Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 

 Wei Yang

 

 Adaptation of avian influenza viruses to the respiratory epithelium of pigs

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108791

title (ger.)

Adaptation aviärer Influenzaviren an das respiratorische Epithel von Schweinen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/yangw_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Schweine sind ein wichtiger Wirt für Influenza-A-Viren und können eine wichtige Rolle bei der Interspezies-Übertragung spielen. In früheren Studien haben wir Präzisionslungenschnitte (precision-cut lung slices, PCLS) von der Schweinelunge als Kultursystem für differenzierte Atemwegsepithelzellen etabliert, um die Infektion dieser Zellen durch Influenzaviren zu infizieren (Punyadarsaniya et al., 2011; Meng et al., 2013).

 

In dieser These wurde ein aviäres Influenzavirus, A/chicken/Saudi Arabia/7/1998 (P0) des H9N2-Subtyps in PCLS drei Mal passagiert (P1-P3), um die Adaptation von aviären Influenzaviren an die Vermehrung in einem Säugetier-Wirt zu analysieren. Die mit der Adaptation assoziierten Veränderungen in den Viruseigenschaften wurden charakterisiert, indem folgende Parameter bestimmt wurden: (i) die Menge des in den Überstand freigesetzten Virus, (ii) die Vermehrungskurve der passagierten Viren, und (iii) der ziliostatische Effekt. Nach drei Passagen war der einzige Unterschied zwischen den verschiedenen Viren eine schnellere Vermehrungskinetik des P3-Virus. Sequenzanalysen der verschiedenen Viruspassagen ergaben vier Mutationen: je eine im PB2- und NS1-Protein und zwei im HA-Protein.

 

Die HA Mutationen, A190V and T212I, sowie the PB2-Mutation, G685R, wurden näher charakterisiert, indem rekombinante Viren erzeugt wurden, die eine oder zwei der Aminosäure-Austausche enthielten. Die Ergebnisse der „glycan array“-Analyse zeigten, dass das aviäre Ausgangsvirus bevorzugt a2,3-verknüpfte Sialinsäure erkannte. Die HA190-Mutante band an ein breites Spektrum von Glykanen mit a2,6/8/9-verknüpften Sialinsäuren. Die HA212-Mutantion allein führte zu weniger ausgeprägten Änderungen, aber zusammen mit der HA212-Mutation resultierte daraus eine gesteigerte Bindungsaffinität. Bei der Analyse in NPTr-Zellen zeigten die HA190 und die Doppelmutante (HA190+PB2685) eine schnellere Vermehrungskurve und höhere Virustiter als das Elternvirus, während in PCLS keine der Mutationen eine ziliostatische Wirkung auf die Epithelzellen hatte, wie es charakteristisch wäre für virulente Schweineinfluenzaviren. Man sollte aber beachten, dass die Doppelmutanten (HA190+HA212, HA190+PB2685 and HA212+PB2685) eine signifikant erhöhte Pathogenität in Mäusen zeigten.

 

Alle diese Ergebnisse zusammengenommen, haben wir herausgefunden, dass die Mutationen, die im HA- und im PB2-Protein aufgetreten sind, nur einen frühen Adaptationsschritt des aviären H9N2-Virus darstellen; weitere Mutationen werden nötig sein für diese Viren, bevor sie für Schweine virulent werden können. Deshalb wird es bei künftigen Arbeiten interessant sein, das aviäre H9N2-Virus durch zusätzliche Passagen in PCLS weiter zu adaptieren

 

abstract (englisch)

Pigs are important hosts for influenza A viruses and may play a crucial role in the interspecies transmission. In previous studies (Punyadarsaniya et al., 2011; Meng et al., 2013), we have established precision-cut lung slices (PCLS) from the porcine lung as a culture system for differentiated respiratory epithelial cells to analyze the infection by influenza viruses.

 

In this thesis, an avian influenza virus, A/chicken/Saudi Arabia/7/1998 (P0) of the H9N2 subtype was passaged in PCLS three times (P1-P3) to analyze the adaptation of avian influenza viruses to growth in a mammalian host. The changes in the viral properties that are associated with the adaptation were characterized by determining (i) the amount of infectious virus released into the supernatant, (ii) the growth curve of the passaged viruses and (iii) the ciliostatic effect. After three passages, the only difference noted were increased growth kinetics of the P3 virus. Sequence analysis of the different virus passages revealed four mutations: one each in the PB2 and NS1 proteins, and two in the HA protein.  

 

The HA mutations, A190V and T212I, as well as the PB2 mutation, G685R, were characterized by generating recombinant viruses containing either one or two amino acid exchanges. The results of the glycan array analysis indicated that the parental virus preferentially recognized a2,3-linked sialic acids. The HA190 mutant bound to a broad spectrum of glycans with a2,6/8/9-linked sialic acids. The HA212 mutation alone had a less pronounced effect, however, together with the HA190 mutation it resulted in an increased binding affinity. When we analyzed all the recombinant viruses in NPTr cells, the HA190 mutant and the double mutant (HA190+PB2685) showed a faster growth and higher virus titers than the parental virus, while in PCLS, none of those mutations had a ciliostatic effect on the epithelial cells, which would be a characteristic for virulent swine influenza viruses.

 

It is worth noting that the double mutants (HA190+HA212, HA190+PB2685 and HA212+PB2685) showed significantly increased pathogenicity in mice. Taken all of the results together, we found that the mutations that occured in the HA and the PB2 proteins are just an early adaptation step of avian H9N2 strains; further mutational changes may be required for these viruses to become virulent for pigs. Therefore, it will be interesting in the future to adapt the avian H9N2 virus further by additional passaging in porcine PCLS.

 

keywords

Influenza viruses, adaption, mutation, Influenzaviren, Adaption, Mutation

kb

1.865