Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Christian Marc Wunderlich

Adaptation und Etablierung des Monozyten-Aktivierungstests (MAT) für die Durchführung mit bovinem Vollblut

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105330

title (engl.)

Adaptation and establishment of the Monocyte Activation Test (MAT) for use with bovine whole blood

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/wunderlichc_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine mögliche Nutzung von bovinem Vollblut zur Endotoxinerkennung sowie zum Nachweis  anderer Pyrogene in Anlehnung an den bereits mit Humanblut etablierten Monozyten-Aktivierungstest (MAT) zu entwickeln und zu evaluieren. Zusätzlich sollte im Vergleich die Sensitivität des bovinen Vollblut-Assays (BVA) mit dem MAT verglichen werden.

Die Pyrogenprüfung, unter anderem von Arzneimitteln sowie anderen Medizinprodukten, ist eine vorgeschriebene und wichtige Prozedur, die im Laufe der Jahre unter Nutzung von verschiedenen Verfahren immer standardisierbarer und sensitiver wurde. Die derzeit in der Europäischen Union genutzten Verfahren, der Kaninchen Pyrogentest (RPT), der Limulus-Amöbozyten-Lysat Test (LAL) und der Monozyten-Aktivierungstest, bieten je nach genutztem Verfahren eine hinreichende Sicherheit. Allerdings sind unter Gesichtspunkten wie dem 3R-Konzept (Replacement, Reduction, Refinement) und Nachhaltigkeit im Umgang mit Humanblut Forderungen nach Alternativen nachvollziehbar. Bisherige Bemühungen zur Nutzung von Blut tierischen Ursprungs im Sinne der Pyrogendetektion waren auf Kaninchen- sowie Hundeblut begrenzt und zeigten wenig überzeugende Daten. Die Spezies Rind lässt auf Grund großer Homologie in der Toll-Like-Receptor-Ausstattung im Vergleich zum Menschen zumindest eine ähnliche Reaktion erwarten. Arbeiten zur Pyrogenprüfung mit Rinderblut in Anlehnung an den MAT lagen bisher nicht vor.

Die grundlegende Eignung des Rinderblutes zum Pyrogennachweis wurde in verschiedenen Versuchsansätzen mit dem Endotoxin von E.coli 0111:B4 untersucht.

Da ein Zytokinnachweis trotz Nutzung diverser, für die Nutzung mit Rindermaterial angebotener ELISA nicht gelang, wurde die Prostaglandin E2 (PGE2)-Freisetzung als Read out genutzt.  Nach einer ersten Optimierung der Methode und erfolgversprechenden Vorversuchen konnte mit dem Blut von 9 Rindern LPS von 0111:B4 bis in den Bereich von 0,16 EU/ml nachgewiesen werden.

Die bei den bisher etablierten Verfahren – abgesehen vom MAT – vorliegenden Nachteile, nämlich die fehlende Standardisierbarkeit des RPT und die Beschränkung des LAL auf Endotoxine, sollten bei einem neu zu etablierenden Verfahren nicht vorhanden sein. Daher wurden neben anderen Endotoxinen, u.a. von E.coli 0127:B8 und 0113:H10, auch Nicht-Endotoxin-Pyrogene (NEP) – Peptidoglykan (PGN) von Bacillus subtilis und Lipoteichonsäure (LTA) von Stapylococcus aureus – verwendet. Mit Blut von mindestens 5 Rindern konnte reproduzierbar LPS 0127:B8 bis zu einer Konzentration von 0,08 EU/ml, 0113:H10 bis zu 0,25 EU/ml, PGN  bis zu 10 µg/ml und LTA ebenfalls bis zu 10 µg/ml nachgewiesen werden. Auf Grund dieser Ergebnisse schloss sich ein Vergleich mit dem MAT an. Dieser ergab beim WHO-Standardendotoxin (E.coli 0113:H10) ein identisches Detektionslevel von 0,25 EU/ml, was die Anforderung des Europäischen Arzneibuches (EAB) im Hinblick auf die Endotoxinerkennung erfüllte, denn zulässig sind bis zu 0,5 EU/ml. Gegenüber LPS von E.coli 0127:B8 sowie PGN und LTA war der MAT geringgradig empfindlicher, wobei die erreichten Detektionsgrenzen beider Testverfahren keine Gefährdung durch Pyrogenkontaminationen erwarten ließen.

Mit der vorliegenden Arbeit konnte ein Verfahren zum Nachweis sowohl von Endotoxinen als auch von Nicht-Endotoxin-Pyrogenen entwickelt werden, das auf Grund der Nutzung von leicht standardisierbarem und ausreichend verfügbarem Rinderblut einige Vorteile im Vergleich zur Nutzung von Humanblut bietet.

 

abstract (englisch)

This study aimed to develop and evaluate a method using bovine whole blood for the detection of endotoxin and non-endotoxin pyrogens based on the principle of the established human Monocyte Activation Test (MAT). In addition to that the sensitivity of the bovine whole blood assay (bWBA) should be compared to that of the MAT.

Pyrogen detection in pharmaceutical products is a mandatory and important procedure, which became more and more sensitive and standardized employing different methods in recent years. Todays used methods in the European Union (EU), the rabbit pyrogen test (RPT), the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) test and the Monocyte Activation Test, ensure sufficient product safety. However, with respect to the 3R-concept (replacement, reduction, refinement) and sustainability regarding human blood, a demand for alternatives seems reasonable. Previous investigations employing blood of animal origin for pyrogen detection was limited to rabbit and dog blood and resulted in less than convincing data. Since there is a great homology in toll-like-receptor (TLR) equipment between cattle and men a similar reaction to pyrogens could be anticipated. Yet, there was no data supporting the suitability of bovine blood for pyrogen testing based on the principle of the MAT.

The general applicability of bovine whole blood for pyrogen detection was investigated in different experimental setups using the endotoxin of E.coli 0111:B4. As the measurement of cytokine release was not successful despite employing different cytokine ELISAs, allegedly approved for bovine samples, Prostaglandin E2 (PGE2) liberation was used as read out. After promising preliminary experiments and a first optimization of the method LPS 0111:B4 could be detected with a detection limit of 0.16 EU/ml utilizing blood of 9 cows.

The disadvantages of the former methods – apart from the MAT – i.e. the lack of standardization of the RPT and the endotoxin restriction of the LAL, should not pertain to a new established method. Because of that the bWBA was tested with other LPS from E.coli 0127:B8 and 0113:H10 and with non-endotoxin pyrogens – peptidoglycan (PGN) from Bacillus subtilis and lipoteichoic acid (LTA) from Staphylococcus aureus. The results obtained using blood from at least 5 cows showed reproducible detection limits of 0.08 EU/ml for LPS 0127:B8, 0.25 EU/ml for LPS 0113:H10, 10 µg/ml for PGN and 10 µg/ml for LTA.

Based on these results the bWBA and MAT were directly compared subsequently. This setup resulted in an identical detection limit for the WHO standard endotoxin (E.coli 0113:H10) of 0.25 EU/ml, thus fulfilling the requirements of the European Pharmacopoeia for endotoxin detection of 0.5 EU/ml. With respect to LPS from E.coli 0127:B8, PGN as well as LTA the MAT appeared to be somewhat more sensitive. Nevertheless, the attained detection limits of both test systems would identify a possible hazard due to pyrogen contamination.

This study demonstrated the establishment of a procedure for endotoxin as well as non-endotoxin pyrogen detection. Due to the use of easily standardizable and readily available bovine blood the new method offers different advantages compared to the use of human blood.

keywords

Bovines Vollblut, Monozyten Aktivierungstest, Pyrogene; bovine whole blood, Monocyte Activation Test, pyrogens

kb

3.819