Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 

 Nai-Huei Wu

 

Co-infection of porcine respiratory epithelial cells

by influenza viruses and Streptococcus suis

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108782

title (ger.)

Co-Infektionen porziner respiratorischer Epithelzellen durch Influenzaviren und Streptococcus suis

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/wun_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Bakterielle Sekundärinfektionen können den Schweregrad einer Influenzavirusinfektion sowohl im Menschen als auch im Tier steigern.

Die Pathogenese viral-bakterieller Co-Infektionen ist im Vergleich zu viralen Mono-Infektionen viel komplexer und die Wechselwirkungen zwischen den beiden Pathogenen einerseits und dem Wirt andererseits sind bisher kaum untersucht. Ziel dieser Arbeit ist es, die Interaktionen eines viralen und eines bakteriellen Erregers mit einem Wirt bei der Mono- bzw. Co-Infektion zu untersuchen.

Streptococcus suis (S. suis) wurde als bakterieller Sekundärerreger gewählt, um die Co-Infektion mit Schweine-Influenzaviren (SIV) zu analysieren. Beide infektiöse Agenzien haben zoonotisches Potenzial und stellen wichtige respiratorische Pathogene dar, die mit dem „porcine respiratory disease complex“ assoziiert werden. In dieser Arbeit habe ich drei verschiedene Infektionsmodelle zur Anwendung gebracht, um die Infektion durch SIV und/oder S. suis genauer zu analysieren.: (i) immortalisierte Zellen von der Trachea neugeborener Schweine (newborn pig trachea, NPTr cells), (ii) Präzisionslungenschnitte (precision-cut lunge slices, PCLS) und (iii) sogenannte „Air-liquid interface“ (ALI)-Kulturen von primären porzinen Atemwegszellen.

Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich den Co-Infektionsprozess und damit die Interaktionen zwischen SIV, S. suis und dem Wirt in NPTr-Zellen und PCLS - einem in vitro- und einem in vivo-Modell - untersucht. Zudem wurde analysiert, ob es Unterschiede zwischen zwei SIV-Feldstämmen verschiedener Subtypen (H1N1 und H3N2), im Weiteren als SIV-H1N1 und SIV-H3N2 bezeichnet, gibt. Die Bedeutung des bakteriellen Kapselpolysaccharids während der SIV-S. suis-Co-Infektion wurde erforscht, indem der S. suis-Stamm 10 mit einer isogenen unbekapselten Mutante verglichen wurde. Ich konnte eine wechselseitige Interaktion nachweisen, die vom SIV-Hämagglutinin (HA)-Protein vermittelt wurde, das die α2,6-verknüpften Sialinsäuren auf dem Kapelpolysaccharid von S. suis erkannte. Diese direkte Interaktion zwischen Virus und Bakterium verzögerte die Replikation von SIV-H1N1 und SIV-H3N2. Andererseits förderte das auf der Oberfläche von SIV-infizierten Zellen exprimierte HA-Protein die Adhärenz und Kolonisation von S. suis bei NPTr-Zellen. Dieser Effekt wurde auch bei PCLS in der Frühphase der Infektion beobachtet. In der Spätphase der Infektion schädigte SIV die mukoziliäre Reinigungsfunktion der PCLS und förderte dadurch die Adhärenz und Invasion von S. suis. Meine Ergebnisse zeigen, dass SIV-infizierte Zellen zunächst über eine sialinsäure-abhängige Interaktion und dann über eine Schädigung des Epithels die bakterielle Adhärenz und Invasion erleichtern. Außerdem hatte die bakterielle Co-Infektion über die sialinsäure-abhängige Interaktion einen negativen Effekt auf die Virusreplikation.

Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich zwei ALI-Kultursysteme für primäre enddifferenzierte Atemwegsepithelzellen, porzine Trachealepithelzellen (PTEC) und porzine Bronchialepithelzellen (PBEC), etabliert, um die Wechselwirkungen zwischen Atemwegsepithelzellen und Influenzaviren zu untersuchen. Um die SIV-Infektion näher zu charakterisieren, wurden SIV-H1N1 und SIV-H3N2 verwendet, sowie zwei rekombinante humane Viren, R1 und R2, um den Phänotyp von Viren mit unterschiedlicher Sialinsäure-Präferenz zu analysieren. Ich fand heraus,dass die beiden SIV-Stämme zilientragende und nicht-zilientragende Zellen infizierten, jedoch keine mukus-produzierenden Zellen. Außerdem induzierten sie in infizierten Zellen Apoptose. Die SIV-Infektion führte zu einem dramatischen Verlust von Zilien, zu einer reduzierten Dicke der Epithelschicht und zu einer Exposition von Basalzellen auf der apikalen Seite des Epithels. Lektinfärbung zeigte, dass diese Zellen ein unterschiedliches Muster von Sialinsäuren auf der Zelloberfläche exprimieren. Dies liefert eine Erklärung, warum Influenzavirus-Infektionen den Wirt für viral-bakterielle Co-Infektionen prädisponieren. Außerdem behält das Epithel trotz der schädlichen Wirkung der SIV-Infektion seine Barrierefunktion bei und beginnt mit dem Regenerierungsprozess durch Differenzierung der Basalzellen zu spezialisierten Zelltypen. Meine Ergebnisse bieten einen tieferen Einblick in die Wechselwirkungen zwischen Influenzaviren und Atemwegsepithelzellen bei Langzeitinfektionen. Außerdem liefern ALI-Kulturen ein Modell, mit dem man nicht nur die SIV-induzierten Wirkungen untersuchen kann, sondern auch den Regenerierungsprozess des Epithels nach einer Influenzavirus-Infektion.

Weiterhin wurde in Kollaboration mit Fandan Meng das ALI-Kultursystem genutzt um die Mono-Infektion enddifferenzierter respiratorischer Epithelzellen durch S. suis zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass Suilysin, ein lösliches Cytolysin von S. suis, , die Adhärenz an und die Invasion von porzinen respiratorischen Epithelzellen erleichtert. Im Verlaufe der Infektion induzierte S. suis eine suilysin-vermittelte Apoptose, die zu einer Schädigung des Epithels führte. Diese Befunde zeigen, dass die Sekretion von Suilysin durch S. suis sowohl zur Adhärenz und Invasion als auch zur Apoptose beiträgt.

Nachdem mit den ALI-Kulturen die Mono-Infektionen durch SIV und S. suis charakterisiert wurden, kann dieses Kultursystem in Zukunft auch für die Untersuchung der Co-Infektion genutzt werden.

 

abstract (englisch)

The severity of influenza virus-induced disease may be enhanced by secondary bacterial infections in both humans and animals. The pathogenesis of viral-bacterial co-infections is much more complex than that of viral mono-infections. Furthermore, the action and counteractions between the two pathogens and the host still remain poorly understood. Aim of this study was to investigate the interaction between a viral and a bacterial pathogen in a specific host during mono-infection or co-infection. Streptococcus suis (S. suis) was chosen as the secondary bacterial pathogen to analyze the co-infection with swine influenza virus (SIV). Both infectious agents have a zoonotic potential and represent important respiratory pathogens associated with the porcine respiratory disease complex (PRDC). I applied three different infection models: (i) immortalized newborn pig trachea (NPTr) cells, (ii) porcine precision-cut lung slices (PCLS), and (iii) air-liquid interface (ALI) cultures of primary porcine airway epithelial cells to analyze the infection by SIV and/or S. suis in more detail.

 

In the first part of this study, I investigated the co-infection process with the NPTr cell line as well as with PCLS, to analyze the interaction between SIV, S. suis and the host in an in vitro and an ex vivo model, respectively. Two SIV field strains of different subtypes (H1N1 and H3N2), designated SIV-H1N1 and SIV-H3N2, were used to figure out whether there are differences between these influenza virus subtypes. The importance of the bacterial capsular polysaccharide during SIV-S. suis co-infection was studied by comparing the S. suis strain 10 and its noncapsulated isogenic mutant. I could show a bilateral interaction mediated by the SIV haemagglutinin (HA) protein which recognized the α2,6-linked sialic acid present on the S. suis capsular polysaccharide. This direct viral-bacterial interaction delayed the replication of SIV-H1N1 and SIV-H3N2. On the other hand, the HA protein expressed on the surface of SIV-infected cells promoted S. suis adherence to and colonization of NPTr cells. This effect was also observed in PCLS at the early stage of co-infection. Afterwards, at the late stage of infection, SIV damaged the mucociliary clearance function of PCLS and promoted S. suis adherence and invasion. My results indicate that SIV-infected cells facilitate the bacterial adherence and invasion, first via a sialic acid-dependent interaction and later by a damage of the epithelium. In addition, bacterial co-infection had a negative effect on influenza virus replication mediated by the sialic acid-dependent interaction.

 

In the second part of my thesis, I established two primary well-differentiated ALI cultures, porcine tracheal epithelial cells (PTEC) and porcine bronchial epithelial cells (PBEC) cultures, to study the action and counteraction between airway epithelial cells and influenza viruses. The infection characteristics of SIV were determined with SIV-H1N1 and SIV-H3N2 whereas two recombinant human viruses, R1 and R2, were used to analyze the phenotype of viruses with a different sialic acid-binding preference. I discovered that both SIV strains targeted ciliated cells and non-ciliated cells but not mucus-producing cells. Furthermore, they induced apoptosis in infected cells. SIV infection resulted in a dramatic loss of cilia, reduction of the epithelial thickness and exposure of basal cells on the apical surface of the epithelial cell layer. Lectin staining indicated that these cells have a different expression pattern of surface markers compared to well-differentiated epithelial cells. This may explain why influenza virus infection may predispose the host to viral/bacterial co-infections. On the other hand, despite the detrimental effect of SIV infection, the epithelium still maintained its barrier function and the regeneration of differentiated cells from basal cells was initiated. My results provide a deeper insight into the action and counteraction between influenza viruses and airway epithelial cells in long term infections. Additionally, ALI cultures supply a model to study not only SIV-induced effects but also the regeneration process of the epithelium after influenza virus infections.

 

Furthermore, in collaboration with Fandan Meng, we used the ALI culture system to analyze the mono-infection of well-differentiated respiratory epithelial cells by S. suis. suilysin, a soluble cytolysin of S. suis, was found to facilitate adherence to and invasion of porcine respiratory epithelial cells. During infection, S. suis induced suilysin-mediated apoptosis resulting in an impairment of the epithelium. These findings demonstrate that the secretion of suilysin by S. suis contributes to adherence to and invasion of porcine epithelial cells as well as to apoptosis.

 

Having analyzed the mono-infection of ALI cultures by SIV and S. suis, this culture system can now be used to investigate the co-infection.

 

keywords

Influenzaviren, Streptococcus suis, Co-Infektion, influenza virus, Streptococcus suis, co-infection

kb

2.452