Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Antonina Wrzeszcz

 

Funktionalisierung des Trägermaterials von Cochlea-Implantaten mittels Dexamethason und Hydrogel: Effekt auf Bindegewebe in vitro und in vivo im Meerschweinchen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104520

title (engl.)

Functionalization of the carrier material of cochlear implants using dexamethasone and hydrogel: effect on connective tissue in vitro and in vivo in guinea pigs

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/wrzeszcza_ws13.pdf

abstract (deutsch)

Die Insertion von Cochlea-Implantaten ins Innenohr bewirkt häufig Entzündungsreaktionen und Fibrose in der Scala tympani und somit Bindegewebswachstum auf der Implantatoberfläche. Dies führt zu Funktionsverlusten und erhöhtem Energieverbrauch des Gerätes. Die Zielsetzung dieser Dissertation war die Reduktion von Bindegewebswachstum durch Dexamethason (Dex), freigesetzt aus dem Trägermaterial der Implantate (Polydimethylsiloxan, PDMS). Um Zell- und Proteinadhäsion zu verhindern, wurde dieses Silikon mit einer zusätzlichen Hydrogelschicht versehen (star shaped polyethylene glycol prepolymer, sPEG). Die Wirkstofffreisetzungsraten wurden über 3 Monate untersucht und es wurde eine Oberflächencharakterisierung durchgeführt. Wir beobachteten, dass die Hydrogelbeschichtung eine leichte Glättung der Oberfläche bewirkte, die durch die Dex-Kristalle aufgeraut worden war. Das Gel führte zu einer reduzierten und verlängerten Freisetzung des Medikaments über mehrere Monate. Unmodifizierte, sPEG-beschichtete, Dex-beladene und Dex/sPEG-bestückte PDMS-Filamente wurden in vitro mit fluoreszierenden Fibroblasten kokultiviert und nach einem Zeitintervall von 5 bzw. 7 Tagen quantifiziert. Es zeigte sich, dass eine erfolgreiche Dex-Freisetzung über einen langen Zeitraum von Monaten bis vermutlich Jahren machbar ist. Verglichen mit den unmodifizierten PDMS-Dummys wiesen alle modifizierten Filamente um durchschnittlich 95 % reduzierte Zellzahlen auf ihrer Oberfläche auf. Sowohl Dex als auch sPEG allein reduzierten bereits die Zellbesiedelung der Probenoberflächen (92-93 %), während die Kombination beider in vitro zum besten Ergebnis führte (99 %). Zudem war durch die Diffusion des Wirkstoffs ins Kulturmedium das Zellwachstum auf dem Boden der Dex-Proben enthaltenden Kulturplatten um ca. 70 % herabgesetzt.

Des Weiteren wurden die gleichen Probentypen unilateral bei Meerschweinchen implantiert. Nach 4 Wochen wurde der Hörstatus der Tiere überprüft und anschließend sowohl die Implantatposition als auch das Volumen des fibrösen Gewebes in der Scala tympani analysiert. Dazu wurden mittels Konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) transparente Komplettpräparate der Cochleae untersucht. Diese neu modifizierte Methode hat den Vorteil, fast vollautomatisch abzulaufen und ist ohne Ausbleichen mehrfach wiederholbar. Die Cochleae behalten ihre geometrische Struktur bei, während das Gewebe nur minimale bis keine Schrumpfungsartefakte und Schäden aufweist, was bei anderen histologischen Techniken unvermeidbar ist. Die CLSM eignete sich zudem hervorragend zur Darstellung des Rosenthalschen Kanals und der Quantifizierung der darin enthaltenen Spiralganglienzellen (SGZ): Hierzu wurden die Zellen erst manuell und dann software-gestützt ausgezählt. Zum Vergleich wurden in Paraffin eingebettete und geschnittene Meerschweinchencochleae ebenso analysiert. Die mittels CLSM untersuchten SGZ erreichten einen durchschnittlichen Durchmesser von 21 µm und eine Dichte von ca. 18 Zellen/10.000 µm² (n=8), wohingegen bei den Paraffinschnitten sich nur mittlere Durchmesser von 13,6 µm und eine Dichte von 9,5 Zellen/10.000 µm² (n=8) fanden. Zwischen manueller und automatischer Zählung gab es keine signifikante Differenz. Dies lässt darauf schließen, dass die semi-automatische CLSM-Methode eine aufwandsarme und effektive Zellzähl-Technik mit hohem Gewebeerhaltungsgrad darstellt. Zudem bietet sie die Möglichkeit, sowohl die Lage und Orientierung von Cochlea-Implantaten als auch Bindegewebswachstum darauf und in der Scala zu ermitteln.

In vivo fanden sich keine signifikanten Unterschiede der Hörschwellen in den implantierten Tiergruppen. Dennoch waren sPEG, Dex sowie deren Kombination (Dex/sPEG) in der Lage, die Bildung von Bindegewebe um die Implantate herum um jeweils ca. 55,  90 und 80 % zu reduzieren. Ähnlich der in vitro Ergebnisse erreichten Dex-beladene Proben durch Diffusion des Wirkstoffs eine stärkere Wachstumsinhibition auch in der umgebenden Scala tympani. Die in den Mittelwerten sichtbaren Tendenzen erwiesen sich jedoch als statistisch nicht signifikant, was vermutlich mit einer höheren Anzahl auszuwertender Tiere verbessert werden könnte.

Beide Studien liefern dennoch Belege dafür, dass das untersuchte Drug Delivery System eine erfolgreiche Langzeitfreisetzung von Dexamethason ermöglicht und dass es in vitro eine sehr gute, in vivo eine tendenzielle Reduktion von fibrösem Gewebe erreicht. Dies bietet eine vielversprechende Grundlage für weitere Untersuchungen. Die hier neu modifizierte Auswertungsmethode mittels CLSM erwies sich zudem als hervorragend geeignet zur semi-automatisierbaren histologischen und morphometrischen Analyse ganzer Cochleae mit darin enthaltenen Implantaten. Sie bietet damit eine attraktive Alternative zu den klassischen Methoden.

 

abstract (englisch)

The insertion of cochlear implants into the inner ear often causes inflammation and fibrosis inside the scala tympani and thus growth of fibrous tissue on the implant surface. This leads to function loss and increased energy consumption of the device. The design of this thesis was to realize fibroblast growth inhibition by dexamethasone (Dex) released from the base material of the implant (polydimethylsiloxane, PDMS). To prevent cell and protein adhesion, the PDMS was coated with a hydrogel layer (star shaped polyethylene glycol prepolymer, sPEG).

Drug release rates were studied over 3 months and surface characterization was performed. It was observed that the hydrogel slightly smoothened the surface roughened by the Dex crystals. The hydrogel coating reduced and prolonged the release of the drug over several months. Unmodified, sPEG-coated, Dex-loaded and Dex/sPEG-equipped PDMS filaments were co-cultivated in vitro with fluorescent fibroblasts which were quantified after an interval of 5 or 7 days. The release of Dex from the drug delivery system was proved to be feasible over a long time span, from months probably up to years. Compared to the unmodified PDMS, cell growth on all modified filaments was averagely 95% less, while cell growth on the bottom of the culture dishes containing Dex-loaded filaments was reduced by 70% due to the drug diffusion into the culture medium. Both modifications Dex and sPEG reduce the cell proliferation separately (92-93 %) or combined, from which the latter provides the best results (99 %).

As second step, the same filament types were implanted unilaterally into guinea pigs. After 4 weeks the hearing status of the animals was measured and the implant position as well as volume amount of fibrosis at the implantation site were analyzed using Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) in transparent whole mount preparations. This modified version of the method has the advantage to be nearly fully-automatic and frequently repeatable with various objectives and step sizes between sections and without visible bleaching. The cochleae keep their geometrical structure while the tissue shows minimal or no shrinking artefacts and damage typical of embedding and sectioning in other histological techniques. The CLSM proved also to be a highly effective technique to visualize Rosenthal’s Canal and to quantify the spiral ganglion neurons (SGN) within. Hereto, the neurons were first counted manually and then software-assisted. For comparison, guinea pig cochleae embedded in paraffin were examined similarly. The SGN analyzed by CLSM reached an average diameter of 21 µm and a density of about 18 cells/10,000 µm2 (n=8), whereas the paraffin SGN reached only a mean soma diameter of 13.6 µm and a mean density of 9.5 cells/10,000 µm2 (n=8). No significant difference between the manual and the automatic counts was found. This indicates that the semi-automatic CLSM method is a simple and effective technique for auditory neuron count, providing a high grade of tissue preservation. In addition, it offers the potential to detect the position and orientation of cochlear implants within the cochlea, as well as tissue growing around the implant and at the the cochleostomy site.

In vivo, the hearing status after implantation did not differ significantly in the treated animal groups. Dex, sPEG as well as their combination Dex/sPEG were able to reduce formation of connective tissue around the implant by about 90, 55  and 80 %, respectively. Similar to the in vitro results, through diffusion the implants containing Dex led to higher reduction also in the surrounding scala tympani. However, although tendencies were visible in the mean values, these results were not statistically significant, probably due to the limited number of cochleae included in the analysis.

Nevertheless, both studies provide evidence that the investigated drug delivery system enables a successful long term release of dexamethasone, achieving in vitro a very good reduction of fibrous tissue, in vivo by tendency. This provides a promising basis for further studies. Furthermore, the modified version of the CLSM method combined with the Spalteholz-technique proved to be highly effective for semi-automatic histological and morphometric analysis of whole mount cochleae with implants. It is an attractive alternative to the traditional methods.

 

keywords

Dexamethason, Hydrogel, Cochlea Implantat, Dexamethasone, hydrogel, cochlear implant

kb

9.696