Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Tanja Wostradowski

Deciphering the mode of action of drugs used in the treatment of multiple sclerosis

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108773

title (ger.)

Aufklärung der Wirkungsweise verschiedener Therapeutika zur Behandlung der Multiplen Sklerose

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/wostradowskit_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch-entzündliche Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die überwiegend durch eine T-Zell vermittelte Autoimmunreaktion gegen Myelinantigene hervorgerufen wird. Entsprechend den Erkenntnissen aus experimentellen Modellen, geht man davon aus, dass es bei der MS zu einer Aktivierung autoreaktiver T-Zellen und einem Funktionsverlust der Blut-Hirnschranke kommt. Dies führt zur Infiltration, lokalen Reaktivierung und Proliferation verschiedener Immunzellen, die eine lokale Entzündungskaskade initiieren können. Kennzeichen der MS sind folglich Inflammation, Demyelinisierung und axonale Pathologien, die sich in vielfältigen neurologischen Defiziten widerspiegeln. Obwohl periphere T-Lymphozyten lange als Ziel verschiedener MS-Therapeutika im Mittelpunkt standen, gewinnen zunehmend Therapien an Bedeutung, die zusätzlich gegen Zellen im ZNS wie Mikroglia und Astrozyten gerichtet sind.

Interferon (IFN)-β ist seit mehr als 20 Jahren eine wirksame, sichere Behandlungsmethode der schubförmigen und teils der sekundär-progredienten Multiplen Sklerose. IFN-β beeinflusst das Entzündungsgeschehen, indem es unter anderem die Einwanderung von Lymphozyten in das ZNS reduziert. Es wurde gezeigt, dass IFN-β1b, vermittelt über die Expression von RGS1 (negative regulator of G-protein signaling), die Chemokin CXCL12-induzierte Migration von mononuklearen Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) hemmt. Dennoch ist der Wirkmechanismus von IFN-β nur teilweise verstanden. Demgegenüber stehen neue Therapieformen zur peroralen Applikation für die Behandlung von MS, wie z.B. Teriflunomid, dessen Effekte auf das Immunsystem und auf Zellen des ZNS bis dato nur unzureichend untersucht sind.

Teriflunomid ist, wie IFN-β, ein Immunmodulator. Der genaue Wirkmechanismus von Teriflunomid ist bisher nicht vollständig geklärt. Es wirkt durch die nichtkompetitive, reversible Blockierung des mitochondrialen Enzyms Dihydroorotat-Dehydrogenase (DHODH), einem Schlüsselenzym der Pyrimidin-Biosynthese. So wird insbesondere die Proliferation aktivierter T- und B-Zellen gehemmt. Verschiedene Studien zeigten zudem, dass durch Teriflunomid die Produktion einiger pro-inflammatorischer Zytokine durch Makrophagen reduziert wird.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit möglichen Wirkmechanismen verschiedener Therapeutika zur Behandlung der MS. Einerseits kann CXCL12-abhängige T-Zell Migration in vitro/in vivo in MS-Patienten durch IFN-β beeinflusst werden, anderseits kann die Aktivierung und Proliferation von Mikroglia durch physiologisch relevante Konzentrationen von Teriflunomid (0-5 µM) moduliert werden.

Unsere Ergebnisse aus dem ersten Teil der Arbeit zeigen deutlich eine Hemmung der CXCL12-abhängigen Migration von humanen T-Zellen von gesunden Probanden und von RRMS-Patienten (in vitro) durch IFN-β nach 20 h Behandlung. In Untersuchungen der CXCR4/CXCL12-abhängigen und IFN-β1b-induzierten Signalkaskaden konnten wir zeigen, dass IFN-β1b ausgewählte Signalwege nicht beeinflusst. Im Gegensatz dazu reduziert IFN-β1b die Expression des Rezeptors CXCR4 in T-Zellen von gesunden Probanden und von RRMS-Patienten in vitro. Eine Hemmung der Migration bei MS-Patienten in vivo war nicht ersichtlich. Daraus kann man schließen, dass der aufgedeckte Mechanismus auf der Herunterregulierung der CXCR4 Expression auf Transkriptionsebene basieren könnte.

Im zweiten Teil der Arbeit haben wir untersucht, ob Teriflunomid neben den beschriebenen Effekten auf Leukozyten auch die Proliferation und Funktion von Mikroglia beeinflussen kann. Wir konnten zeigen, dass Teriflunomid die Proliferation von aktivierten Mikroglia aus gemischten Gliazellkulturen hemmt. Darüber hinaus konnten wir einen minimalen Einfluss von Teriflunomid auf immunmodulatorische Faktoren in aktivierten Mikroglia feststellen. Zu einem zeigte Teriflunomid eine leichte, aber signifikante Hochregulierung des anti-inflammatorischen Mediators IL-10, zum anderem eine Reduktion des co-stimulierenden Moleküls CD86 nach Aktivierung mit LPS. Andererseits inhibierte Teriflunomid nicht den NF-κB Signalweg, was mit einer Reduktion von inflammatorischen Zytokinen und Adhäsionsmolekülen einhergegangen wäre. Unsere Ergebnisse legen nahe, das Teriflunomid keine bedeutende Rolle in der Regulation inflammatorischer Funktionen einnimmt.

Zusammenfassend konnten wir feststellen, dass die Wirkmechanismen verschiedener Substanzen zur Behandlung der MS, in vitro sowohl einen Einfluss auf Immunzellen aus der Peripherie als auch auf Zellen des ZNS nehmen können, sofern sie in der Lage sind in vivo die Bluthirnschranke zu überwinden. Die Ergebnisse unterstreichen Effekte von IFN-β und Teriflunomid auf wichtige Zelltypen, die abhängig von den gegebenen Bedingungen Einfluss auf den Krankheitsverlauf der MS haben könnten.

abstract (englisch)

Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory, demyelinating, and neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS). A key event of its pathology is the infiltration of activated leukocytes into the CNS.

Interferon (IFN)-β1b is licensed for the treatment of relapsing forms of MS to reduce the frequency of clinical exacerbations. The effect of IFN-β is thought to be mediated by the modulation of immune cells including an effect on leukocyte infiltration into the CNS. The chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 are involved in this process of transmigration into the CNS. Although IFN-β has been shown to decrease CXCL12-induced cell migration in PBMCs, it is not clear whether IFN-β plays a role in CXCL12-induced migration of T cells. Inhibition of CXCR4-dependent leukocyte migration could be one of the mechanisms of immunomodulation by IFN-β1b. T cells have been shown to express the type I IFN receptor complex (IFNAR1/2) that is necessary for IFN signaling. Our objective was to investigate a crosstalk of key elements in IFN-β and CXCR4 signaling cascade and functional CXCL12-dependent response in T cells after in vitro IFN-β treatment, and to determine differences in CXCR4 expression and function in MS patients compared to healthy controls.

We could demonstrate that IFN-β1b (1000 U/ml) reduced CXCL12-dependent migration of primary human T cells from healthy individuals and RRMS patients in vitro. IFN-β1b pretreatment did not lead to a reduction of either ERK1/2 or AKT phosphorylation. However, CXCR4 surface expression was reduced after 24 h of IFN-β1b pretreatment as measured by flow cytometry. Quantitative real time-PCR revealed a similar reduction in CXCR4-mRNA. The IFN-β1b induced reduction in migration and CXCR4 expression might not mediated by early intracellular signaling events downstream of CXCR4 activation induced by CXCL12. The requirement of several hours’ exposure to IFN-β1b supports a transcriptional regulation. Interestingly, T cells of MS patients showed a lower CXCR4 expression than healthy individuals in vivo, which was not further reduced in patients under IFN-β1b therapy.

A main characteristic of neuroinflammatory diseases such as MS is microglial proliferation and activation. The role of microglia in MS pathogenesis is highly debatable since both beneficial as well as detrimental functions have been proposed. To gain insights on effects of teriflunomide on microglial activation and proliferation, in vitro experiments with rat microglial cultures were performed.

We analyzed whether teriflunomide influences cellular reactions and immune function of microglia by treatment with physiologically relevant concentrations (0-5 µM). Besides investigations on proliferation of microglia we examined the polarization of microglia into a pro-inflammatory (M1-like) and anti-inflammatory (M2-like) phenotype under the treatment of teriflunomide. For the proliferation assay, mixed glial cell cultures were stimulated by different concentrations of teriflunomide together with GM-CSF. Here, we concluded that teriflunomide exerted significant inhibition of microglial proliferation in mixed glial cell cultures activated with GM-CSF. Only treatment with 5 µM teriflunomide slightly increased expression of the anti-inflammatory cytokine IL-10 from activated microglia. In addition, we found that teriflunomide leads to significantly decreased expression of co-stimulatory molecule CD86 in LPS-activated microglia; however, teriflunomide did not modulate pro-inflammatory phenotype of primary rat microglia. Furthermore, we observed no influence of teriflunomide on the phagocytic activity of unstimulated or LPS-activated microglia.

Taken together, a better characterization of molecular pathways of either IFN-β or teriflunomide might help to identify new drug targets for an add-on therapy to improve the efficacy of a MS therapy or differentiate between treatment responder from non-responder.

keywords

Multiple sclerosis, immunomodulatory drug, primary cell cultures, Multiple Sklerose (MS), MS-Therapeutika, primär Zellkulturen

kb

1.663