Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Stefanie Witte

Optimierung der Isolation und Kultivierung primärer

boviner Hepatozyten mit besonderer

Berücksichtigung des Wachstumshormonrezeptors

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111071

title (eng.)

Improvement of the isolation and cultivation of primary bovine hepatocytes with particular regard of the growth hormone receptor

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/wittes_ws17.pdf

abstract (deutsch)

In vivo kommt es bei der Milchkuh peripartal zu einer verminderten Ansprechbarkeit des GHR für GH, was wiederum zu einer niedrigen IGF-I-Konzentration im Blut der Tiere führt (Radcliff et al., 2003; Piechotta et al., 2014). Dieser Zustand wird auch als GH-Resistenz bezeichnet. Verschiedene in-vivo-Studien konnten die kausalen Regulationsmechanismen dieser Ereignisse bisher nicht detailliert aufdecken. Mit einem in-vitro-Modell wäre es möglich, spezifisch die Regulationsmechanismen des hepatischen GHR/IGFISystems der Milchkuh näher zu untersuchen. Bisher ist allerdings keine Zelllinie adulter boviner Hepatozyten mit den charakteristischen Eigenschaften der adulten Leberparenchymzellen verfügbar. Zudem sind primäre Hepatozyten den Leberzellen in vivo trotz ihrer kurzen Lebensspanne am ähnlichsten. Ehrhardt und Schmicke (2016) konnten bereits mittels einer Zwei-Schritt Kollagenaseperfusion aus Schlachthoflebern mit einer langen warmen Ischämiezeit primäre Hepatozyten vom Rind gewinnen. Jedoch war die Viabilität und Zellzahl der primären Hepatozyten lediglich moderat und die Expression des GHR und von IGF-I der Hepatozyten wurde in Kultur drastisch herunterreguliert. Ziel dieser Dissertation war es die Isolation und Kultivierung primärer Hepatozyten vom Rind zu verbessern. Zudem sollten Einflüsse der Kultivierung auf die Expression der Komponenten des hepatischen GHR/IGF-I-Systems untersucht werden, um die primären Hepatozyten in zukünftigen endokrinologischen Studien zur Untersuchung des hepatischen GHR/IGF-I-Systems der Milchkuh einzusetzen. Mit dem Ziel die Viabilität und Zellzahl der primären bovinen Hepatozyten zu verbessern, wurden Modifikationen am Isolationsablauf von Ehrhardt und Schmicke (2016) durchgeführt. Dazu gehörte die Erhöhung des Spülvolumens direkt nach der Gewinnung des Leberteilstücks, die Änderung der Pufferzusammensetzung sowie die Anpassung der verwendeten Kollagenasemenge an das Gewicht des Leberteilstücks. Im Rahmen dieser Dissertation standen außerdem drei Gruppen von Lebern mit unterschiedlichen WIZ zur Verfügung, um den Einfluss der WIZ auf den Isolationserfolg zu untersuchen. Die mittels des modifizierten Isolationsablaufs gewonnen primären Hepatozyten vom Rind wurden anschließend in Monolayer- und Sandwich-Konfiguration kultiviert. Dabei wurden vor allem in der Sandwichkultur der Effekt von Dexamethason und Insulin als essentielle, hormonelle Zusätze zum Kulturmedium primärer Hepatozyten untersucht sowie der Effekt des Zusatzes verschiedener Glucosekonzentrationen. Es konnte gezeigt werden, dass Dexamethason die polygonale Morphologie und leberspezifische Funktionen der Hepatozyten in Kultur erhält. Die hohen Glucosekonzentrationen in Williams‘ Medium E von 10 mM sind an den Bedarf von Hepatozyten von Nagern angepasst. Beim ruminierenden Tier im Gegensatz zum Monogastrier wird Glucose zum größten Teil aus SCFA in der Leber gebildet (Bergman, 1990; Baldwin et al., 2004). Zur Beurteilung der Vitalität und leberspezifischer Funktionen der Zellen in Kultur wurden die Aktivität der Laktatdehydrogenase und die Harnstoffsynthese im Medium sowie die Albumin, HNF4α, IκBα, PEPCK-C und Vimentin mRNA-Expressionen bestimmt. Neben der Vitalität und Funktionalität der primären bovinen Hepatozyten bei verschiedenen Kultivierungsbedingungen wurde auch die Expression der Komponenten des hepatischen GHR/IGF-I-Systems untersucht. Dazu wurde die mRNA-Expression von GHRtot, GHR1A, IGF-I und IGFBP2 herangezogen. Die Ergebnisse der Isolationen zeigten, dass durch die Modifikationen des Isolationsablaufs, die in dieser Dissertation etabliert wurden, die Isolation primärer Hepatozyten vom Rind optimiert werden konnte. Es konnten mit dem modifizierten Isolationsablauf eine deutlich höhere Viabilität und Zellzahl aus Lebern mit einer WIZ < 18 min im Vergleich zum originalen Protokoll erreicht werden. Bei Schlachthoflebern mit einer langen WIZ von 28 – 30 min war die Verbesserung der Viabilität und Zellzahl durch die Modifikationen weniger deutlich. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Hepatozyten aus Lebern mit einer langen WIZ schon vor der ZweiSchritt Kollagenaseperfusion irreversibel geschädigt sein könnten und daher der Anteil vitaler Hepatozyten deutlich geringer ist. Die Untersuchung der Hepatozyten in verschiedenen Kultivierungssystemen zeigte die Überlegenheit der Kultivierung von primären Hepatozyten über einige Tage in Sandwichkultur gegenüber der Monolayerkultur. Nach vier Tagen in Sandwichkultur zeigten die Zellen eine hepatozytenspezifische polygonale Morphologie, waren vital und hormonell ansprechbar. In Sandwichkultur zeigten die Hepatozyten eine deutliche Inhibition der GHRtot, GHR1A und IGF-I mRNA-Expression durch Dexamethason. Insulin dagegen hatte eine stimulierende Wirkung auf diese Genexpressionen. Bei Kultivierung ohne Glucose im Medium war die Vitalität der primären Rinderhepatozyten besser und die Dedifferenzierung der Zellen geringer als bei einer hohen Konzentration von 10 mM Glucose. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass mit dem modifizierten Isolationsablauf deutlich mehr vitale Hepatozyten vom Rind gewonnen werden können, wenn die Zellschäden durch die WIZ noch nicht zu groß sind. Außerdem kann durch Kultivierung der primären Rinderhepatozyten ohne Dexamethason mit dem stimulierenden Effekt von Insulin die GHRtot, GHR1A und IGF-I mRNA-Expression der primären Hepatozyten in Kultur sichergestellt werden. Zudem zeigten diese Untersuchungen, dass die GHRExpression bei den primären Hepatozyten in Kultur ähnlich reguliert wird wie bei Leberzellen in vivo. In zukünftigen Arbeiten sollte deshalb die Dexamethasonkonzentration im Kulturmedium erniedrigt oder alternative Substanzen, wie Hydrocortison oder andere antiinflammatorische Zusätze, erprobt werden, die zu einer weniger potenten Inhibition von GHR1A und IGF-I führen, aber dennoch die Vitalität der Hepatozyten in Kultur sicherstellen.

abstract (englisch)

During the transition from late pregnancy to early lactation the GHR displayed a reduced responsiveness for GH in dairy cattle which leads to a lower IGF-I concentration in the blood (Radcliff et al., 2003; Piechotta et al., 2014). This hyporesponsive state is also referred to as GH-resistance or “uncoupling of the somatotropic axis”. Although there have been different in vivo studies on this topic the underlying regulatory mechanisms could not be fully elucidated yet. With an in vitro model, it would be possible to specifically examine the regulatory mechanisms of the hepatic GHR/IGF-I system in cows. Until now, there is no cell line of bovine hepatocytes available which displays the characteristics of adult hepatocytes. Furthermore, primary hepatocytes are the most in vivo like in vitro system to study liver function despite of their shorter life span in contrast to a specific hepatocyte cell line. With a two-step collagenase perfusion, Ehrhardt and Schmicke (2016) already isolated primary hepatocytes from the liver of cattle. These livers were sampled after a “long” warm ischemia time (> 18 min) at the slaughterhouse. Tough, the viability and cell yield of the primary bovine hepatocytes were only moderate and the expression of GHR and IGF-I in these cells was heavily downregulated in culture. The aim of the present study was to improve the isolation and cultivation of primary hepatocytes from cattle. In addition, effects of the cultivation on the expression of the hepatic GHR/IGF-I system should be examined in detail with the purpose to establish a model of primary hepatocytes for endocrine studies of the hepatic GHR/IGF-I system of dairy cattle. With the aim to optimize the viability and cell yield of primary bovine hepatocytes the isolation protocol from Ehrhardt and Schmicke (2016) has been modified. Modifications included a higher rinsing volume after collection of the liver, a modified buffer composition and a defined collagenase amount per gram of liver. Additionally, livers gained after different warm ischemia times were collected to investigate the effect of warm ischemia on the success of isolation. In addition, primary bovine hepatocyte isolated with the modified isolation protocol have been cultivated in monolayer and sandwich culture. Especially in the sandwich culture, the effects of insulin and dexamethasone as essential hormonal additives to the medium as well as the effect of different glucose concentrations have been studied. Dexamethasone is necessary to maintain a polygonal morphology and liver-specific functions in the cultured hepatocytes as previously shown and confirmed by the data of the present study. High glucose concentrations in Williams’ medium E with 10 mM are widely used in rodents. In ruminating animals however, glucose is mainly produced from SCFA in the liver by gluconeogenesis (Bergman, 1990; Baldwin et al., 2004). To evaluate the vitality and liver-specific functions of the cells in culture the activity of lactate dehydrogenase and urea synthesis as well as albumin, HNF4α, IκBα, PEPCK-C and Vimentin mRNA expressions were determined. Additionally, the mRNA expression of the hepatic GHR/IGF-I system, GHRtot, GHR1A, IGF-I and IGFBP-2, was measured. The isolation of hepatocytes with the modified isolation protocol established in this study indicated a higher viability and cell yield of bovine hepatocytes from livers with a warm ischemia time < 18 min. When hepatocytes were isolated from livers with a “long” warm ischemia time of 28 – 30 min, the viability and cell yield achieved with the modified isolation protocol were not significantly higher when isolated with the original protocol. The results indicate that an irreversible damage of the hepatocytes from livers with a long warm ischemia time takes place before the two-step collagenase perfusion due to prolonged warm ischemia. When investigating the hepatocytes in different culture systems for several days, the cultivation of bovine hepatocytes in sandwich culture were superior over the cultivation in monolayer culture. After four days in sandwich culture, the hepatocytes formed a typical polygonal shape, were vital and hormonally responsive. In sandwich culture, the hepatocytes showed a distinct inhibition of the GHRtot, GHR1A and IGF-I mRNA expression by dexamethasone. Insulin in contrast had a stimulatory effect on these gene expression levels. Cultivation of the hepatocytes in medium without glucose had a positive effect on the cell vitality and the dedifferentiation process. In conclusion, the modified isolation protocol allows the isolation of a higher quantity of vital primary hepatocytes from cattle. Furthermore, the cultivation without dexamethasone but with the stimulatory effect of insulin ensures the expression of GHRtot, GHR1A and IGF-I in the primary bovine hepatocytes in culture. These results revealed the same regulatory mechanisms of the GHR expression in vitro and in vivo. In further studies, the concentration of dexamethasone in the culture medium should be reduced or alternative substrates as hydrocortisone or other anti-inflammatory additives should be tested which lead to a less potent inhibition of GHRtot, GHR1A, IGF-I expression but still support the vitality of the hepatocytes in culture.

keywords

primäre bovine Hepatozyten, Wachstumshormonrezeptor, Zellkultur, primary bovine hepatocytes, growth hormone receptor, cell culture

kb

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