Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Jasmin Wissemann

Untersuchung zur biologischen Aktivität von transgenem equinem Interleukin-12 nach intratumoraler Injektion

von Plasmid-DNA in Melanome beim Pferd

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107039

title (engl.)

Analysis on biological activity of transgene equine interleukin-12 after intratumoral injection of plasmid DNA in melanoma in horses

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/wissemannj_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Bei annähernd 80 % aller Schimmel bilden sich ab einem Alter von 15 Jahren Melanome aus. Bisher existieren keine erfolgreichen Therapieverfahren gegen das equine Melanom. Aus zahlreichen wissenschaftlichen Arbeiten geht hervor, dass das Zytokin Interleukin-12 zur Tumorregression führt und antimetastatische Wirkungen besitzt. Mit Erfolg wurden einige Studien durchgeführt, bei denen für IL-12 kodierende Plasmid-DNA in Melanome von Pferden, Mäusen und Menschen verabreicht wurde und eine signifikante Regression bei sämtlichen behandelten Tumoren beobachtet werden konnte. Leider liegen nur wenige Informationen über die Verteilung und die Expressionseigenschaften von intratumoral injizierter IL-12-Plasmid-DNA innerhalb des Tumorgewebes vor.

Das Ziel dieser Studie bestand in der Ermittlung der Eliminations- und Expressionskinetik intratumoral verabreichter für IL-12 kodierender Plasmid-DNA in Melanome beim Schimmel. Daneben wurde zum Nachweis der biologischen Aktivität der IL-12-Plasmid-DNA die Expression der IFN-g-mRNA im Tumorgewebe gemessen.

In der vorliegenden Untersuchung erhielten neun Schimmel mit Melanomen jeweils eine einmalige intratumorale Injektion mit 250 µg für IL-12 kodierender Plasmid-DNA.

Die erste Probenentnahme von Tumorgewebe und Blut erfolgte zehn Minuten vor der Plasmid-DNA-Injektion. Die weiteren Probenentnahmen erfolgten 10 min, 30 min,

2 h, 4 h, 12 h, 24 h, 36 h, 60 h, 5 d, 7 d, 9 d und 14 d nach der Injektion. Unter Verwendung der Real-Time PCR wurde bei den Pferden 1 bis 7 die Plasmid-DNA-Menge im venösen Blut quantifiziert sowie die Expression der IL-12-Plasmid-mRNA und der IFN-g-mRNA im Tumorgewebe untersucht. Bei den Pferden 8 und 9 wurde der Gehalt an Plasmid-DNA im Tumorgewebe ebenfalls mittels der Real-Time PCR bestimmt.

Bei den behandelten Pferden traten keinerlei unerwünschte Wirkungen auf. Die höchsten Konzentrationen von Plasmid-DNA im Blut wurden mit Werten von bis zu 17 x 104 Kopien/ml (Min: 26 x 103 Kopien/ml; Max: 16 x 105 Kopien/ml) zehn Minuten bis zwei Stunden nach der intratumoralen Injektion festgestellt. Im folgenden Zeitraum stellte sich eine rasche Abnahme der Plasmid-DNA-Konzentration ein. Bei fünf Pferden wurde innerhalb der ersten vier Stunden ein zweiter Anstieg der Kopienzahl im Blut auf bis zu 47 x 103 Plasmid-DNA-Kopien/ml (Min: 48 x 102 Kopien/ml; Max: 24 x 104 Kopien/ml) beobachtet. Sechzig Stunden nach der Applikation war bei allen sieben Pferden die Nachweisgrenze unterschritten. Die transgene Expression der IL-12-Plasmid-mRNA erhöhte sich nach 30 Minuten post injectionem um das 48 x 104-fache (Min: 238,9-fach; Max: 216 x 106-fach) und wies bis zur letzten Probenentnahme ein 1,8-fach erhöhtes Expressionsniveau auf (Min: 0,3-fach; Max: 104,3-fach). Außerdem konnte eine Induktion der IFN-g-mRNA-Expression im Tumorgewebe mit einer Steigerung um das 1,6-fache (Min: 0; Max: 16 x 102-fach) nachgewiesen werden. Die intratumoral injizierte Plasmid-DNA zeigte innerhalb der ersten zwei Stunden eine rasche Elimination aus dem Tumorgewebe. Bis zum 14. Tag post injectionem waren Plasmid-DNA-Kopien in einer Höhe von 10 x 103/ml Isolat bei Pferd 8 und 77 x 104/ml Isolat bei Pferd 9 im Bereich der Injektionsstelle nachweisbar.

In der vorliegenden Studie konnte festgestellt werden, dass der Hauptanteil der intratumoral injizierten Plasmid-DNA innerhalb von vier Stunden aus dem Blut eliminiert wird. Daneben führte die einmalige intratumorale Injektion von für equines IL-12 kodierender Plasmid-DNA zu einer Expression von IL-12-Plasmid-mRNA und zu einer deutlichen Induktion der IFN-g-mRNA-Synthese im Tumorgewebe. Die Plasmid-DNA konnte bis zu vierzehn Tage post injectionem im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Daraus kann abgeleitet werden, dass für IL-12 kodierende Plasmid-DNA die Fähigkeit besitzt, Zellen in vivo zu transfizieren und durch die Expression von biologisch aktivem IL-12 eine Antitumorwirkung zu entfalten.

abstract (englisch)

Almost 80 % of all grey horses develop melanoma after the age of fifteen. Until now there are no successful treatments against equine melanoma. Numerous scientific studies show that the cytokine interleukin-12 induce tumour regression, and has an antimetastatic effect. In several studies plasmid DNA coding IL-12 has been injected in melanoma of humans, mice and horses and a significant regression in all treated tumours was observed. Unfortunately little is known about the distribution and expression characteristics of intratumorally injected IL-12 plasmid DNA in tumour tissue.

The aim of this study was to investigate the elimination and expression kinetics of intratumorally injected plasmid DNA coding for equine interleukin-12 in melanoma in grey horses. Additionally the expression of IFN-g mRNA in tumour tissue was determined to prove the biological activity of IL-12 plasmid DNA.

In the present study nine grey horses bearing melanomas received a single intratumoral injection with 250 µg plasmid DNA coding for equine IL-12. The first taken sample of tumour tissue and blood was ten minutes after the injection of plasmid DNA. The following samples were taken 10 min, 30 min, 2 h, 4 h, 12 h, 24 h, 36 h, 60 h, 5 d, 7 d, 9 d, and 14 d after the injection. Real-time PCR was used to quantify the plasmid DNA amount in the venous blood and the expression of IL-12 plasmid mRNA and IFN-g mRNA in the injected tumour tissue in the horses 1 to 7. In the tumour tissue of the horses 8 and 9 the amount of plasmid DNA was determined using real-time PCR as well.

In the treated horses no side effects could be seen. The highest count of plasmid DNA in blood with values of up to 17 x 104 copies/ml (Min: 26 x 103 copies/ml; Max: 16 x 105 copies/ml) could be determined ten minutes to two hours after intratumoral injection. In the following period the concentration of plasmid DNA decreased rapidly. A second peak of copy numbers within the first four hours up to 47 x 103 plasmid DNA copies/ml (Min: 48 x 102 copies/ml; Max: 24 x 104 copies/ml) was observed in five horses. Sixty hours after the application in all seven horses the plasmid DNA concentration fell below the detection limit. During the first 30 minutes the transgene expression of IL-12 plasmid mRNA increase to 48 x 104-fold (Min: 238.9-fold; Max: 216 x 106-fold), and showed an 1.8-fold elevated expression level until the last taken sample (Min: 0.3-fold; Max: 104.3-fold). Moreover an induction of IFN-g mRNA expression could be detected in tumour tissue with an 1.6-fold increase (Min: 0; Max: 16 x 102-fold). The intratumorally injected plasmid DNA showed a rapid elimination from the tumour tissue in the first two hours. Until fourteen days after the injection plasmid DNA could be detected in the tumour tissue with an amount of 10 x 103/ml isolate in horse 8 and 77 x 104/ml isolate in horse 9.

The present work established that the main part of the intratumoral injected plasmid DNA was eliminated out of the blood within four hours. Additionally the single intratumoral injection of plasmid DNA coding for equine IL-12 induced an expression of IL-12 plasmid mRNA, and an induction of IFN-g mRNA synthesis in the tumour tissue. Fourteen days after the injection plasmid DNA could still be detected in the tumour tissue.

It can be assumed that plasmid DNA coding for equine IL-12 has the ability to transfect cells in vivo an induce an antitumour effect through the expression of biologically active interleukin-12.

keywords

Melanome, Plasmid-DNA, Interleukin-12, melanoma, plasmid-DNA, interleukin-12

kb

6.214