Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Jenny Wilzopolski

Untersuchungen zur Transmission des über den Histamin-4-Rezeptor induzierten Juckreizsignals

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111054

title (eng.)

Investigations on the transmission of the histamin-4-receptor-induced itch signal.

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/wilzopolskij_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Histamin ist seit langem als Juckreizmediator bekannt. Es entfaltet seine Wirkung über vier G-proteingekoppelte Rezeptoren, die Histamin-1 – 4-Rezeptoren (H1 – 4R). Der H1R und H4R scheinen Schlüsselrollen bei der Weiterleitung des histamininduzierten Juckreizes zu spielen. Aktuelle Publikationen deuten auf eine Beteiligung des transient receptor potential vanilloid receptor 1 (TRPV1)-Kanals am histamininduzierten Juckreiz hin. Neben dem TRPV1-Kanal spielt auch der transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1)-Kanal eine Schlüsselrolle in der Weiterleitung von akuten, pruritogenen Stimuli. Die Rolle dieses Kanals und weiterer mit der Aktivierung der TRP-Kanäle assoziierter Effektormoleküle bei histamininduziertem Juckreiz ist bisher unklar.

Ziel dieser Arbeit war es, Teile des intrazellulären Signalweges des H4R zu ermitteln. Hierfür wurde zunächst die Sensitivität der vier Mausstämme BALB/c, C57BL/6, NMRI und CD-1 gegenüber einer intradermalen Gabe des H4R-Agonisten 4-Methylhistamin (4-MH) untersucht. Es zeigten sich, wie bereits für Histamin beschrieben, C57BL/6- und CD-1-Mäuse am sensitivsten. Letztere wurden für die weiteren Untersuchungen genutzt. In Juckreizverhaltensstudien an diesen Mäusen konnte die Beteiligung des TRPV1-Kanals am über den H1R und H4R induzierten Juckreiz mittels TRPV1-Inhibitoren bestätigt und mit TRPV1-/--Mäusen untermauert werden. Zudem konnte hier zum ersten Mal gezeigt werden, dass auch der TRPA1-Kanal an der Übertragung des über H4R induzierten Juckreizsignals beteiligt ist. Sowohl der histamin- als auch der über den H4R induzierte Juckreiz waren durch TRPA1-Inhibitoren und im TRPA1-/--Mausmodell im Vergleich zum Wildtyp reduziert. Für eine Bestätigung in vitro wurden DRG-Neurone aus CD-1-Mäusen isoliert und mittels Ca2+-Influxmessungen untersucht. Hier konnte ebenfalls der durch Histamin und der über den H4R induzierte intrazelluläre Ca2+-Anstieg durch TRPA1- und TRPV1-Inhibitoren reduziert werden. Eine Applikation des als TRPV1/TRPA1-Kanal-Inhibitor verwendeten Ruthenium Red und auch Verhaltensuntersuchungen an TRPV1-/-/TRPA1-/--Mäusen brachten überraschenderweise keine vollständige Reduktion der über den H4R induzierten Reaktion. Dies deutet auf eine Beteiligung weiterer Strukturen/Ionenkanäle am intrazellulären Signalweg des H4Rs in DRG-Neuronen hin. Um weitere, dem H4R nachgeschaltete Effektormoleküle zu ermitteln, wurde der Einfluss von Proteinkinase A/C (PKA/PKC)-, Phospholipase A2/C (PLA2/PLC)- und Adenylylzyklase (AC)-Inhibitoren auf den histamininduzierten Juckreiz untersucht. Für den über den H1R induzierten Juckreiz konnten eine Beteiligung der PLA2, PLC und PKC bestätigt werden. Für den über den H4R induzierten Juckreiz konnte eine Beteiligung der PLA2 und PKA gezeigt werden. Die Rolle der PKC scheint beim intrazellulären Signalweg des H4R eine inhibitorische Rolle zu spielen. Durch ihre Inhibition wurde der über den H4R induzierte Juckreiz dosisabhängig verstärkt. Eine Beteiligung der PLC konnte nicht bestätigt werden. Der verwendete AC-Inhibitor zeigte in der verwendeten Dosierung keinen Effekt auf histamininduzierten Juckreiz. Im weiteren Verlauf wurde die Fähigkeit des H2R-Agonisten Amthamin Juckreiz auszulösen evaluiert. Überraschenderweise konnte die verwendete Substanz in CD-1-Mäusen dosisabhängig Juckreiz auslösen.      

Der H4R ist im ZNS exprimiert und übernimmt dort verschiedene, neurophysiologische Funktionen wie Lokomotion, Angst und Nozizeption. Inwiefern der H4R den Juckreiz zentral reguliert, wurde mittels eines ZNS- und eines nicht-ZNS-gängigen H4R-Antagonisten überprüft. Interessanterweise konnte nur der ZNS-gängige Antagonist den über den H4R induzierten Juckreiz hemmen, was auf eine zentrale Steuerung schließen lässt.   

Schließlich wurde mittels Ca2+-Influx-Messungen untersucht, ob es Unterschiede in der Sensitivität der DRG-Neurone der Mausstämme BALB/c, C57BL/6 und CD-1 auf Histamin-, H4R-, TRPA1- und TRPV1-Agonisten gibt. Insgesamt waren bei den auf über den H4R induzierten juckreizsensitiven Stämmen (CD-1, C57BL/6) die Mehrheit der H4R-sensitiven Neurone AITC- und Capsaicin-positiv. Bei den insensitiven BALB/c-Mäusen war die Mehrheit der 4-MH-sensitiven Neurone dagegen nur Capsaicin-positiv. Diese Daten sprechen ebenfalls für eine Beteiligung des TRPV1- und TRPA1-Kanals an der Weiterleitung des intrazellulären Signals des H4R und geben Hinweise darauf, dass unterschiedliche Ionenkanal-/Rezeptor-Expressionsmuster für die Sensitivität der verschiedenen Mausstämme auf Juckreizstimuli wichtig sein könnten.     

Aus den vorliegenden Ergebnissen ist zu schließen, dass TRPV1, TRPA1, PLA2, PKA und PKC an der Übertragung des über den H4R induzierten Juckreizsignals beteiligt sind. Zudem offenbaren sie erste Erkenntnisse in Hinblick auf eine mögliche zentrale Regulation des über den H4R induzierten Juckreizes. Weiterhin legt die vorliegende Studie die Beteiligung des H2R an der Juckreizentstehung und stammspezifische Unterschiede in der Sensibilität gegenüber verschiedener Stimuli auf zellulärer Ebene dar.

abstract (englisch)

Histamine has long been recognized as a classical inducer of pruritus. It acts via four G protein-coupled receptor subtypes, the histamine 1 – 4 receptors (H1-4R). The H1R and the H4R seem to play key roles in the mediation of histamine-induced itch. Recent publications indicate the involvement of the transient receptor potential vanilloid channel 1 (TRPV1) in histamine-induced itch. Beside TRPV1 also the transient receptor potential ankyrin 1 channel (TRPA1) plays a key role in acute itch stimuli transduction. This channel is involved in non-histaminergic itch pathways, but its role and that of other effector molecules in histamine-induced itch is unclear.

Aim of this study was to elucidate parts of the intracellular signalling pathway of the H4R. First the sensitivity of four different mouse strains, namely BALB/c, C57BL/6, NMRI and CD-1, to intradermal H4R-agonist application was examined. As shown for histamine C57BL/6 and CD-1 mice were most sensitive. The latter were used for the present studies. Itch-scratch experiments indicated the involvement of the TRPV1 channel in H1R- and H4R-induced itch as demonstrated by means of TRPV1 inhibitors and TRPV1-/- mice. Additionally the involvement of the TRPA1 channel in the transmission of H4R-induced itch could be shown for the first time. Both histamine- and H4R-induced itch were reduced by a TRPA1 inhibitor and in TRPA1-/- mice. These results were corroborated by in vitro studies in DRG neurons isolated from CD-1 mice. Both histamine- and H4R-induced intracellular Ca2+ increase were blocked by TRPV1 and TRPA1 inhibitors. However, neither the application of the dual TRPV1/TRPA1 inhibitor ruthenium red nor the knock out of the TRPV1 and TRPA1 genes could completely diminish H4R-induced reactions. This might be a hint for the involvement of further ion channels or stimulation pathways. The effect of protein kinase A/C (PKA/PKC), phospholipase A2/C (PLA2/PLC) and adenylyl cyclase (AC) inhibitors on H4R-induced itch have been examined to determine further downstream mechanisms of the H4R. For the H1R-induced itch the involvement of PLA2, PLC and PKC could be confirmed. For the H4R-induced itch an involvement of PLA2 und PKA could be shown. Activation of PKC seems rather to have an inhibitory effect on the transmission of the H4R-induced signal: By inhibition of PKC the H4R-induced itch was increased. PLC involvement couldn't be confirmed. Additionally the AC-inhibitor showed no effect in the dose tested.          

Additionally the ability of the H2R-agonist amthamine to induce pruritus has been elucidated. Surprisingly it induced dose dependent itch in CD-1 mice.      

The H4R is expressed in the CNS and is involved in neurophysiologic functions as locomotion, anxiety and nociception. Whether the H4R-induced pruritus has such a central component was investigated by using antagonists which either do or do not penetrate the blood brain barrier. Interestingly only the substance that could cross the blood brain barrier was able to inhibit H4R-induced itch. Thus H4R-induced itch seems to be centrally regulated. Finally, differences in the sensitivity of DRG-neurons isolated from BALB/c, C57BL/6 and CD-1 mice to histamine, H4R-, TRPV1- and TRPA1-agonists has been examined. In total most of the H4R sensitive neurons from CD-1 and C57BL/6 mice were both TRPV1 and TRPA1 positive. Most of these neurons from BALB/c mice have been only TRPV1 positive. These data emphasize the mutual role of TRPV1 and TRPA1 in H4R-induced itch in CD-1 and C57BL/6 mice. They also indicate that different channel/receptor expression patterns might play an important role in the strain specific pruritogen sensitivity.

In summary this study reveals the involvement of TRPV1, TPRA1, PLA2, PKA and to a certain extent of PKC in the transmission of the H4R-induced itch signal. It also suggests a central regulation of H4R-induced pruritus. Furthermore it shows the involvement of the H2R in the onset of pruritus and strain differences in stimulus sensitivity on a cellular level.

keywords

Juckreiz, Histamin-4-Rezeptor, TRP-Kanäle; pruritus, histamine-4-receptor, trp-channels

kb

1.934