Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Daniela Willms

Wachstumsphasenabhängige Merkmale von Streptococcus suis und deren Bedeutung für das Überleben im Wirt

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106110

title (engl.)

Growth-dependent features of Streptococcus suis and their relevance for the survival in the host

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/willmsd_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Streptoccocus (S.) suis ist ein bedeutender Krankheitserreger des Schweins. Neben Infektionserkrankungen wie Septikämien, Pneumonien, Endokarditiden, Arthritiden oder Meningitiden, können auch asymptomatische Verlaufsformen zur Verbreitung des Keims und zu Verlusten in der Schweinehaltung beitragen. Außerdem gilt S. suis als wichtiger Zoonoseerreger.           
Für das Überleben im Wirt muss der Erreger seinen Stoffwechsel an sich verändernde Umgebungsbedingungen anpassen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, welchen Einfluss die Wachstumsphase von S. suis auf die Ausprägung von Merkmalen hat, die im Hinblick auf die Bildung antibiotikatoleranter Persisterzellen und auf Wechselwirkungen mit porzinen Monozyten von Bedeutung sind.
Im ersten Teil wurde gezeigt, dass S. suis in der stationären Wachstumsphase einen deutlich höheren Anteil antibiotikatoleranter Persisterzellen bildet als in der exponentiellen Wachstumsphase. Diese für die Ausbildung von Persisterzellen typische Wachstumsphasenabhängigkeit, sowie die fehlende Vererbbarkeit der Antibiotikatoleranz und Eliminierung antibiotikatoleranter Zellen nach Re-Inokulation exponentiell gewachsener Bakterien zeigten, dass S. suis höchstwahrscheinlich Typ I-Persister bildet, die durch die limitierenden Bedingungen in der stationären Wachstumsphase ausgelöst werden. Die Persisterzellen wiesen zudem eine wachstumsphasenabhängige Vielfachtoleranz gegenüber Antibiotika unterschiedlicher Wirkstoffklassen auf. In Anwesenheit von Gentamicin zeigte S. suis in der exponentiellen Wachstumsphase eine ebenfalls für das Vorkommen von Persisterzellen typische biphasische Überlebenskinetik. Das Arginin-abbauende Arginin Deiminase System (ADS), kodiert durch das arcABC-Operon, und die damit assoziierten Proteine CcpA (catabolite control protein A) und ArcD (putativer Arginin-Ornithin-Antiporter) scheinen mit der Persisterbildung von S. suis im Zusammenhang zu stehen. Die Beteiligung des globalen Regulators CcpA lässt darauf schließen, dass mehrere Gene in der Persisterbildung von S. suis involviert sind, und dass Virulenz, Metabolismus und Persistenz evtl. miteinander verknüpft sind. Des Weiteren wurde eine Antibiotikatoleranz sowohl für die S. suis-Stämme A3286/94 und 05ZYH33, als auch für einzelne Stämme der Spezies S. gordonii, S. pyogenes und S. agalactiae festgestellt. Dies deutet darauf hin, dass die Antibiotikatoleranz in der Familie der Streptococcaceae ein verbreitetes Phänomen sein könnte.        
Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss des bakteriellen Wachstums auf die Interaktion mit Monozyten untersucht, da angenommen wird, dass Monozyten eine wichtige Rolle für die Ausbreitung des Erregers im Gewebe spielen. Laut Trojan horse theory bzw. modifizierter Trojan horse theory gelangt S. suis intrazellulär in Monozyten persistierend bzw. extrazellulär an Monozyten adhärierend ins zentrale Nervensystem (ZNS). Dafür wurde erstmalig ein in-vitro-Infektionsmodell mit über den Oberflächenmarker CD14 affinitätsaufgereinigten naïven porzinen Monozyten im Batch-Verfahren etabliert, das den in-vivo-Bedingungen relativ nahe kommt. Die eingesetzte Monozytensubpopulation exprimierte den Panmonozytenmarker CD172a und die Reifemarker CD163 und CD14, wobei die Expression von CD163 stärker als die von CD14 ausgeprägt war. Durch den Daptomycin protection assay (DPA), sowie Doppelimmunfluoreszenz (DIF)- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Experimente wurde gezeigt, dass S. suis sehr stark an die Monozyten adhärierte, aber kaum von diesen phagozytiert wurde. Der intrazelluläre Nachweis der Kapselmutante 10Δcps, der Suilysinmutante 10Δsly und des Stamms A3286/94 in TEM-Experimenten zeigte, dass S. suis grundsätzlich von porzinen Monozyten internalisiert werden kann. Für S. suis-Stamm 10 konnte eine stärkere Assoziation stationär gewachsener Bakterien und für S. suis-Stamm A3286/94 eine stärkere Assoziation exponentiell gewachsener Bakterien festgestellt werden. Es konnte allerdings nicht geklärt werden, ob dies auf einer unterschiedlichen Vermehrung der Bakterien oder auf eine wachstumsphasenabhängige differentielle Expression von Adhäsinen zurückzuführen war. Weitergehende Untersuchungen zeigten, dass S. suis in der Lage war, sich in Anwesenheit der Monozyten zu vermehren und einen Einfluss auf deren Vitalität und Morphologie hatte. Der Suilysinnachweis im Überstand infizierter Monozyten und durchflusszytometrische Analysen lassen vermuten, dass das durch S. suis-Stamm 10 sezernierte Suilysin die Monozyten schädigte und damit möglicherweise die Phagozytose reduzierte. Eine im Gegensatz zur Kapselmutante 10Δcps fehlende Induktion der Monozyten zur ROS-Produktion durch Stamm 10 deutet zusätzlich darauf, dass die Kapsel vor antibakterieller Aktivität schützt.      
Zusammenfassend zeigte die Arbeit erstmals, dass S. suis in der Lage ist, antibiotikatolerante Persisterzellen zu bilden, und dass die Bildung dieser Persister abhängig vom bakteriellen Wachstum ist. Weiterhin konnten durch ein neues in-vitro-Infektionsmodell mit porzinen Monozyten Erkenntnisse gewonnen werden, die die sogenannte modifizierte Trojan horse theory unterstützen. Der Einfluss der Wachstumsphase auf die Interaktion von S. suis mit Monozyten bleibt allerdings noch zu klären.

abstract (englisch)

Streptoccocus (S.) suis is a major pathogen in pigs. Besides clinical infectious diseases like septicaemia, pneumonia, endocarditis, arthritis or meningitis asymptomatic infections can contribute to spreading of the pathogen and to economical losses in pig husbandry as well. S. suis is also an important zoonotic agent.      
For survival in the host the pathogen has to adapt its metabolism to changing environmental conditions. Therefore the influence of the growth phase of S. suis on the development of features important for forming of antibiotic-tolerant persister cells and for interactions with porcine monocytes was investigated in this thesis.  
The first part revealed that S. suis in stationary growth phase forms a considerable higher number of antibiotic-tolerant cells than in exponential growth phase. This growth dependence, which is typical for the formation of persister cells, the absent heritability of the antibiotic tolerance and the elimination of antibiotic-tolerant cells after re-inoculation of exponential grown bacteria indicated that S. suis most likely forms type I-persisters which are triggered by the limitating conditions in stationary growth phase. Furthermore, the persister cells showed a growth dependent multi-drug tolerance against different classes of antibiotics. In the presence of gentamicin S. suis in exponential growth phase exhibited a biphasic killing kinetic which is also typical for the presence of persister cells. The arginine-catabolic arginine deiminase system (ADS), encoded by the arcABC-operon, the associated proteins CcpA (catabolite control protein A), and ArcD (putative arginine-ornithine-antiporter) seem to be linked to the formation of persisters of S. suis. The involvement of the global regulator CcpA suggests that several genes contribute to persister formation of S. suis-strain 10 and that virulence, metabolism, and persistence may be connected with each other. An antibiotic tolerance was also detected for the S. suis-strains A3286/94 and 05ZYH33 as well as for selected strains of the species S. gordonii, S. pyogenes and S. agalactiae. This indicates that antibiotic tolerance might be widespread within the family Streptococcaceae.

Since it is supposed that monocytes play an important role for the spreading of the pathogen in the tissue the influence of bacterial growth on the interaction with monocytes was investigated in the second part of this work. According to the Trojan horse theory or the modified Trojan horse theory, respectively, S. suis reaches the central nervous system (CNS) persistent in monocytes (intracellularly) or adherent to monocytes (extracellularly), respectively. For this an in-vitro-infection model with naïve porcine monocytes purified via the surface marker CD14 in batch culture, which closely mimicks in-vivo-conditions, was established for the first time. The used monocyte subpopulation expressed the pan-monocytic marker CD172a and the maturity-marker CD163 and CD14, whereas the expression of CD163 was stronger compared to the expression of CD14. A daptomycin protection assay (DPA), as well as double immunofluorescence (DIF) and transmission electron microscopy (TEM) experiments showed that S. suis adhered strongly to the monocytes but was hardly phagocytosed. The intracellular detection of the capsular mutant 10Δcps, of the suilysin deficient mutant 10Δsly and of strain A3286/94 via TEM experiments showed that S. suis can be internalized by porcine monocytes in principal. For S. suis-strain 10 an increased association of stationary grown bacteria and for S. suis-strain A3286/94 an increased association of exponential grown bacteria could be detected. However, it could not be cleared if this was attributed to a different replication of the bacteria or to a growth dependent differential expression of adhesin(s). Further investigations showed that S. suis was able to proliferate in the presence of the monocytes and had an influence on their vitality and morphology. The detection of suilysin in the supernatant of infected monocytes and flow cytometric analyses suggest that the suilysin secreted by S. suis-strain 10 damaged the monocytes and thereby reduced phagocytosis. In addition, a lacking induction of ROS-production of the monocytes by strain 10 in contrast to the capsular mutant 10Δcps suggests that the capsule protects against antibacterial activity.     
Taken together this work showed for the first time that S. suis is able to form antibiotic-tolerant persister cells and that the formation of the persister cells is dependent on bacterial growth. Furthermore, findings obtained by a new in-vitro-infection model with porcine monocytes support the so-called modified Trojan horse theory. However, the influence of the growth phase on the interaction of S. suis with monocytes still has to be cleared.

keywords

Wachstumsphase, Persisterzellen, Wechselwirkung, growth phase, persister cells, interaction

kb

16.590