Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Sabrina Williams

Bedeutung der Maturierung und Migration

von dendritischen Zellen für die Ausbildung

der Atherosklerose

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108748

title (engl.)

Meaning of maturation and migration of dendritic cells for the formation of atherosclerosis

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/williamss_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Die Atherosklerose ist eine chronische Inflammationserkrankung und wird durch atherosklerotische Plaques in der Gefäßwand charakterisiert. Die multifaktoriellen Ursachen setzen sich aus dem individuellen Profil an kardiovaskulären Risikofaktoren des Patienten zusammen. Für die Initiation atherosklerotischer Prozesse sind maßgeblich Zellen des Immunsystems verantwortlich. Dendritische Zellen spielen hierbei eine entscheidende Rolle.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von KVRF auf die Reifung und Migration dendritischer Zellen untersucht. Für die In-vitro-Versuche wurden dendritische Zellen aus dem Knochenmark von C57BL/6 Mäusen generiert. Als Testsubstanzen kamen natives und oxidiertes Lipoprotein, Cholesterin in verschiedenen Konzentrationen, die ein normo- und hyperlipämisches Umfeld simulieren, sowie Nikotin zum Einsatz.

Untersucht wurde die Expression der Maturierungs- und Migrationsmarker auf Proteinebene mittels Durchflusszytometrie, die Genexpression mittels quantitativer Real-Time PCR und das Einwanderungsverhalten stimulierter dendritischen Zellen  in einem Transwell-Migrationsassay. Außer für Nikotin zeigten die durchflusszytometrischen Analysen einen Einfluss der geprüften KVRF auf die Maturierung der DC in vitro. Unter hyperlipämischen Bedingungen kam es zu einer signifikant verminderten Expression von CD40 und zu einer verstärkten Expression von MHC-II-Molekülen. Unter normolipämischen Bedingungen kam es zu einer signifikanten Steigerung der Expression von CD80. Dies lässt vermuten, dass es unter hyperlipämischen Bedingungen zwar zu einer Reifung der DC kommt, deren Aktivierungsfähigkeit für naive T-Zellen jedoch eingeschränkt ist. OxLDL induzierte eine signifikante Steigerung der Expression der Kostimulations-Moleküle CD80 und CD40. Zusammen mit der leicht gesteigerten Expression (nicht signifikant) von  MHC-II-Molekülen bestätigen die Befunde, dass oxLDL in der Lage ist, die Maturierung von DC zu induzieren. Ein hyperlipämisches Umfeld induzierte ebenfalls eine Hochregulation des Chemokinrezeptors CCR7.

Die Ergebnisse der mRNA-Expressionsanalysen zeigten sich nicht durchweg kongruent mit denen der Expressionsanalysen auf Proteinebene. Diese Diskrepanzen könnten auf einer zeitlich zu späten Erfassung der Genexpression beruhen.

Trotz erhöhter CCR7-Expression war die Migrationsfähigkeit der DC in vitro im hyperlipämischen Umfeld vermindert. Da die CCR7-vermittelte Migration häufig durch PGE2 costimuliert wird, wurde untersucht, ob die einzelnen KVRF die PGE2-Synthese negativ beeinflussen. Tatsächlich führten die KVRF, insbesondere Cholesterin, zu einer signifikant erhöhten PGE2-Sekretion. Man kann vermuten, dass endogen sezerniertes PGE2 nicht ausreichend ist, um die Migration zu induzieren, sondern dass DC in vivo während der Maturierung im inflammatorischen Umfeld in Kontakt mit PGE2 aus der Umgebung kommen. Exogenes PGE2 konnte in den Migrationsversuchen die CCL19-induzierte Migration von DC signifikant steigern. Auch unter hyperlipämischen Bedingungen konnte PGE2 die Migration um das 4-fache steigern. Allerdings hemmte das hyperlipämische Umfeld die Migration der DC, die 24 Stunden mit PGE2 vor-inkubiert wurden. Dies zeigt, dass die Migration durch PGE2 zwar gesteigert werden kann, erhöhte Cholesterinwerte jedoch - trotz Anwesenheit von PGE2 - hemmend auf die Migration von DC wirken.

Für die In-vivo-Versuche zur experimentellen Atherosklerose stand das etablierte Modell der LDLR-defizienten Maus (Stammname B6.129S7-Ldlrtm1Her/J) zur Verfügung. Um zu zeigen, welchen Einfluss ein normo- und hyperlipämisches Umfeld auf das Migrationsverhalten in vivo hat, wurde das migratorische Verhalten von dendritischen Zellen im normo- und hyperlipämischen Umfeld zum Zeitpunkt der frühen sowie späten Atherogenese in vivo untersucht.

Ein hyperlipämisches Umfeld in diesen Tieren wurde durch die Fütterung mit einer atherogenen cholesterinreichen Diät für 6 – 16 Wochen induziert. Eine Gruppe erhielt eine atherogene Diät über 6 Wochen (frühe Atherogenese) bzw. 16 Wochen (späte Atherogenese), die andere Gruppe  erhielt eine Standarddiät. Es konnte gezeigt werden, dass die DC zum Zeitpunkt der frühen Atherogenese im normo-, nicht jedoch im hyperlipämischen Umfeld vermehrt zu den regionalen Lymphknoten migrierten. Dies konnte in der späten Atherogenese ebenfalls beobachtet werden, dort waren die Ergebnisse jedoch nicht signifikant.

Die Ergebnisse der ex vivo analysierten DC-Migration decken sich mit den Ergebnissen der In-vitro-Migration. Ein hyperlipämisches Umfeld führt zur verminderten Migration von DC. Für ein „Trapping“ der DC in der Gefäßwand scheinen mehrere verschiedene Faktoren eine Rolle zu spielen. Anders als hypothetisiert konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass ein hyperlipämisches Umfeld nicht zu einer Herabregulation von CCR7 führt, sondern eine Hochregulation induzierte. Durch exogenes PGE2 konnte in den hier durchgeführten Migrationsversuchen die CCL19-induzierte Migration von DC signifikant gesteigert werden. Allerdings hemmte das hyperlipämische Umfeld die Migration der DC, die mit PGE2 vor-inkubiert wurden. Dies zeigt, dass die Migration durch PGE2 zwar gesteigert werden kann, erhöhte Cholesterinwerte jedoch - trotz Anwesenheit von PGE2 - hemmend auf die Migration von DC wirken. Welche Faktoren für diese Hemmung verantwortlich sind, wird Aufgabe weiterer Studien sein.

 

abstract (englisch)

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease characterized by the formation of atherosclerotic plaques in blood vessel walls. Multifactorial causes include the individual profile of cardiovascular risk factors of the patient. Cells of the immune system, with dendritic cells playing the most significant role, are highly responsible for the initiation of atherosclerotic processes.

In this work, the influence of cardiovascular risk factors on the maturation and migration of dendritic cells has been investigated. For in vitro experiments, bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were generated. Examined risk factors included native and oxidized lipoprotein, cholesterol in various concentrations simulating a normo- and hyperlipaemic environment, as well as nicotine.

Flow cytometry was used to examine the expression of maturation and migration markers at the protein level. Quantitative real-time PCR was used to assess gene expression and the immigration pattern of stimulated dendritic cells was studied in a transwell migration assay. Except for nicotine, flow cytometric analyses indicated that the examined cardiovascular risk factors influenced the maturation of the DC in vitro. A hyperlipaemic environment significantly reduced the expression of CD40 and increased the expression of MHC class II molecules. A normolipaemic environment resulted in an increased expression of CD80. It can be speculated, that hyperlipaemic conditions result in DC maturation, but also a limited ability of these cells to activate naïve T cells. OxLDL induced a significantly increased expression of co-stimulatory CD80 and CD40 molecules. Combined with the slightly increased expression of MHC class II molecules, the results confirm that oxLDL is able to induce the maturation of DC. A hyperlipaemic environment also induced an upregulation of the chemokine receptor CCR7.

Expressions at the mRNA level were not completely congruent with the protein expression. This discrepancy is most likely due to a delayed assessment of gene expression.

Despite an increased CCR7 expression, the ability of DC to migrate in vitro was decreased in a hyperlipaemic environment. Because CCR7-mediated migration is often co-stimulated by PGE2, it was analyzed whether the individual cardiovascular risk factors have a negative affect on PGE2 synthesis. Cardiovascular risk factors, especially cholesterol, indeed resulted in an increased PGE2 secretion. It can be assumed that in an inflammatory setting maturating DC come in contact with elevated PGE2 level. Exogenous PGE2 significantly increased CCL19-induced in vitro migration of DC. Likewise, under hyperlipaemic conditions, PGE2 resulted in a four-time higher DC migration. A hyperlipaemic environment, however, inhibited migration of DC preincubated for 24 hours with PGE2. This demonstrated that migration enhancement by PGE2 can be inhibited by elevated cholesterol levels.

LDLR-deficient mice (B6.129S7-Ldlrtm1Her/J), an established model of experimental atherosclerosis, were used for in vivo experiments. To analyze how normo- and hyperlipaemic environments influence migration patterns in vivo, the migratory behavior of dendritic cells in normo- and hyperlipaemic environments were examined in vivo during early as well as late atherosclerosis.

An atherogenic high-cholesterol diet for 6 to 16 weeks induced a hyperlipaemic environment in the animals. One group received an atherogenic diet for 6 weeks (early atherosclerosis) and 16 weeks (late atherosclerosis). A second group received a standard diet. It was shown that in a normo- but not in a hyperlipaemic environment DC at the time of early atherosclerosis increasingly migrate to the local lymph nodes. In tendency, the same was observes during late atherosclerosis.

The results of ex vivo analyzed DC migration corresponded with the in vitro migration results. A hyperlipaemic environment resulted in a decreased migration of DC. Several factors seem to play a role for DC trapping in blood vessel walls. In this work, Regarding DC migration, it has been shown that a hyperlipaemic environment does induce an upregulation of the chemokine receptor CCR7 on DC and that exogenous PGE2, significantly increased the CCL19-induced in vitro DC migration. In contrast, a hyperlipaemic environment inhibited migration of PGE2-primed DC. This shows that DC migration can be increased by PGE2, but that elevated cholesterol levels inhibit DC migration in the presence of PGE2. The responsible factors for this inhibition are subject to future studies

 

keywords

Atherosklerose, dendritische Zellen, Migration Atherosclerosis, dendritic cells, migration

 

kb

4.960