Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Helen Wiese

 

In-vitro-kultivierte Rindereuterhaut zur Charakterisierung des Sensibilisierungspotentials von Chemikalien

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103664

title (engl.)

Use of skin derived bovine dendritic cells to discriminate between potential haptens and irritants

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/wieseh_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Der Tierversuch wird oft eingesetzt, um das sensibilisierende oder irritierende Potential von Chemikalien aufzudecken. Um diese In-vivo-Methoden zu ersetzen, aber auch zu verbessern und zu präzisieren stehen neue tierversuchsfreie Methoden, wie zum Beispiel die Charakterisierung der Expression von Oberflächenmarkern auf dendritischen Zellen, im Zentrum der Forschung. In der vorliegenden Arbeit wird ein In-vitro-Modell zur Charakterisierung des Sensibilisierungspotentials von Chemikalien vorgestellt und bewertet. Dabei ist der Grundgedanke dieser Arbeit eine In-vivo-Situation möglichst realitätsnah zu simulieren. Daher wird auf der noch vitalen aber isolierten bovinen Euterhaut (mit intaktem Stratum corneum) die Testchemikalie aufgetragen. Erst im Anschluss wird die Epidermis mit Hilfe eines Dermatoms von der übrigen Haut abgetragen und weiter kultiviert. Um das Sensibilisierungspotential zu evaluieren, werden mit Hilfe des Skin DC Migration Assays die bovinen dendritischen Zellen aus der Haut (bovine Skin-derived DC) isoliert. Die Anzahl der ausgewandert Zellen wird gezählt und dient zusammen mit der Bestimmung des Expressionmusters ausgewählter Oberflächenmoleküle auf den bovinen dendritischen Zellen als Parameter des sensibilisierenden Potentials. Als Testchemikalien werden die Allergene Toluendiisocyanat (TDI) und 2,4-Dinitrochlorobenzen (DNCB) und als Irritanzien Natriumdodecylsulfat (SDS) und Salicylsäure (SS) in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt.

Die Ergebnisse zeigen, dass in Analogie zum Local Lymph Node Assay (LLNA) eine vermehrte Migrationsbereitschaft nach Allergenstimulation besteht. Allerdings kann auch eine vermehrte dendritische Zell-Migration nach Gabe des Irritanz SDS festgestellt werden, sodass eine Unterscheidung zwischen sensibilisierender und irritierender Substanz auf Basis des Skin-DC Migration Assay nicht getroffen werden kann.

In der Durchflusszytometrie wird die Expression der Oberflächenmoleküle CD14, CD80, CD86 und MHC-II auf den bovinen Skin-derived DC gemessen. Das Ergebnis ist (mit Ausnahme von CD14) eine hohe Expression aller untersuchten Oberflächenmarker bereits in der unbehandelten Kontrollprobe. Damit ist eine weitere Steigerung der Expression nach Haptenstimulation nicht mehr erreichbar. Als mögliche Ursache wird das Isolationsverfahren als solches diskutiert. Um diese Präaktivierung der bovinen dendritischen Zellen zu reduzieren wird ein zweiter Versuchsansatz entwickelt, der eine Isolierung der dendritischen Zellen bereits nach 12 Stunden ermöglicht. Mit Hilfe von Trypsin entsteht eine Zellsuspension, die sich aus dendritischen Zellen und Keratinozyten zusammensetzt. Durch CD80//MHC-II bzw. CD86/MHC-II doppelt-positive Zellen, lassen sich die bovinen dendritischen Zellen sicher von den Keratinozyten abgrenzen. Die Zahl der doppelt-positiven Zellen in der unbehandelten Kontrollprobe kann mit diesem Verfahren gegenüber dem ersten Versuchsansatz deutlich reduziert werden. Nach Stimulation mit den bekannten Allergenen DNCB und TDI kann eine gesteigerte Expression der CD86/MHC-II doppelt-positiven Zellen gemessen werden. Im Gegensatz hierzu wird nach Irritanzgabe (SS) ein Anstieg der Markerexpression in nur einem von vier Versuchen beobachtet.

Damit ist bei dem zweiten Versuchsansatz das sensibilisierende Potential einer chemischen Substanz mit Hilfe der Oberflächenmoleküle CD86 und MHC-II tendenziell abzuleiten. Zukünftig besteht hier noch die Aufgabe, anhand weiterer Versuche die Gültigkeit des Versuchsansatzes auch für das Irritanz SS statistisch sicher nachzuweisen und eine Möglichkeit zu finden, die hohe interindividuelle Variabilität zu minimieren.

 

abstract (englisch)

Today’s most common approach to determine the allergenic or irritating potential of chemical substances is the animal experiment. To reduce, refine and replace these in vivo systems, new methods such as characterisations of surface antigen expression are currently under development. In this thesis, an in vitro based approach to determine the sensitizing potential of different substances is described and evaluated. The major idea is to reproduce the in vivo situation close to reality. To achieve this, isolated but viable bovine skin (with intact stratum corneum) is taken and treated with the test substances. Following this the epidermis is removed by means of dermatom and further cultivated.

In order to determine the sensitizing potential the bovine skin-derived dendritic cells (DC) are isolated via the Skin DC migration assay and the amount is identified. Together with the expression of different surface markers of the dendritic cells an evaluation of the sensitizing potential might be made. Within this thesis tests were performed with the strong haptens toluene diisocyanate (TDI) and 2,4-dinitrochlororbenzene (DNCB) as well as irritants sodium dodecyl sulphate (SDS) and salicylic acid (SS).

It can be shown that in analogy to the Local Lymph Node Assay (LLNA) the experiments with allergenic stimulation lead to an increased migration level. However also the irritant SDS induced an increased dendritic cell migration. This means that within this experimental setting and based on the determined dendritic cell responses a clear differentiation between allergenic and irritant substances is not possible. Via flow-cytometry the expression of CD14, CD80, CD86 and MHC II on the bovine skin-derived dendritic cells is determined. However, already in the untreated control samples a high expression of the different surface markers is detected. Due to this fact it seems unlikely that the incubation with known haptens or irritants will further increase the amount of measured surface markers. One of the reasons for the high activation level of the bovine dendritic cells in the control sample could be the isolation treatment. In order to reduce this pre-activation, another experimental procedure is developed. Within this approach, trypsin is added, a cell suspension including dendritic cells as well as keratinocytes is generated and the isolation of the dendritic cells can take place within 12 hours. Via classification of CD80/MHC-II and CD86/MHC-II double positive cells, a reliable way to distinguish between dendritic cells and keratinocytes is found. With this new approach the amount of surface markers in the control sample is clearly reduced in comparison to the results of the first experimental approach. After incubating in the skin with the haptens DNCB and TDI the quantity of CD86/MHC-II double positive cells increases. In contrast, in the experiments using the irritants SS just one out of four experiments shows an increased marker expression.

Summing up, within this thesis an in vitro method is developed that seems to allow the determination of the sensitizing potential of different chemical substances by examination of the surface molecules of dendritic cell activation. The major task of future work will be to support the results with further haptens/allergens as well as irritants and to find a way to refine the approach by reducing the interindividual variability.

 

keywords

Dendritische Zelle, Kontaktallergie, In-vitro-Modell; dendritic cell, contact hypersensitivity, in-vitro

kb

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