Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 

 Christina Wiechmann   

 

 

 

Staphylococcus epidermidis Biofilmbildung

in Gegenwart von Serum:

genetische Charakterisierung funktioneller Determinanten

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108737

title (engl.)

Staphylococcus epidermidis biofilm formation in the presence of serum:

genetic characterization of functional determinants

 

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/wiechmannc_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Staphylococcus epidermidis wird zu der Gruppe der Koagulase-negativen Staphylokokken gezählt. Die Spezies gehört als Kommensale zu der normalen Flora von Haut und Schleimhaut bei Menschen und Tieren. Im Zusammenhang mit dem Einsatz von implantierten Fremdmaterial, wie zum Beispiel künstlichen Gelenken, Herzklappen oder auch intravaskulären Kathetern, entwickelt S. epidermidis jedoch Pathogenität und ist mitverantwortlich für die steigende Anzahl von Fremdmaterial-assoziierten Infektionen. Dies beruht vor allem auf der Fähigkeit von S. epidermidis sogenannte Biofilme auf abiotischen und biotischen Oberflächen zu bilden.  In bisherigen experimentellen Ansätzen wurde der Biofilmphänotyp vor allem unter artifiziellen Bedingungen untersucht. Dieses Verfahren spiegelt allerdings nur teilweise die Bedingungen in vivo wider und es ist ebenfalls bekannt, dass klinische S. epidermidis Isolate existieren, die je nach Kulturbedingungen einen unterschiedlichen Phänotyp aufweisen. So weist das klinische Isolat S. epidermidis 1585 in Gegenwart eines künstlichen Mediums (TSB) einen biofilmnegativen Phänotyp auf, durch eine Annäherung an in vivo-ähnliche Bedingungen durch  Supplementierung von Ziegenserum konnte allerdings ein biofilmpositiver Phänotyp induziert werden. Unter diesem Gesichtspunkt wurden  Transposonmutanten von S. epidermidis  1585 einer vorangegangenen Transposonmutagenese, die die Fähigkeit einer Serum-abhängigen Biofilmbildung nicht mehr besaßen, näher charakterisiert. Zur Absicherung, dass der beobachtete Phänotypwechsel Folge der Transposoninsertion war und nicht aus sekundären Ereignissen des Transposonmutageneseexperiments resultierte, wurden die chromosomalen Tn917-Insertionen mittels Phagentransduktion in den Wildtypstamm S. epidermidis 1585 transduziert. Zusätzlich wurde, um polare Effekte durch die Insertion des Transposons ausschließen zu können, eine in trans Komplementierung des inaktivierten Genorts durchgeführt, was zu einer Wiederherstellung des Phänotyps des Wildtyps S. epidermidis 1585 in der Transduktante 1585-M66 führte. Als verantwortlicher Genort für den Phänotypwechsel konnte ein pdxR-Homolog, folgend srr  (serum response regulator) genannt, identifiziert werden. Srr kodiert für ein 454  Aminosäuren großes Protein, das C-terminal eine Helix-Turn-Helix (HTH)-Domäne aufweist, sowie N-terminal eine Domäne besitzt, die eine Verwandtschaft  zur Superfamilie der Pyridoxal (PLP)-abhängigen Aspartat-Aminotransferase (AAT)  nahelegt. Folglich konnte Srr in die Familie der GntR-like Transkriptionsfaktoren, und innerhalb dieser, in die MocR-Unterfamilie eingeordnet werden. Eine positive Regulation von Srr auf die ihm angrenzenden Leserahmen SERP0158 und SERP0159, die Homologie zu pdxS beziehungsweise pdxT aufweisen, konnte auf transkriptioneller Ebene festgestellt werden. PdxS und PdxT sind an  der Deoxyxylulose 5-Phosphat (DXP)-unabhängigen Vitamin B6-Biosynthese beteiligt. Die einzige aktive Form des Vitamin B6, das Pyridoxal-5'-Phosphat (PLP), ist als wichtiger Ko-Faktor in vielen prokaryotischen Enzymsystemen, unter anderem dem Aminosäuremetabolismus,  beteiligt. Im Vergleich des Wildtyps S. epidermidis 1585 mit 1585-M66 konnte festgestellt werden, dass die Inaktivierung von srr zu einer reduzierten Biofilmbildung in Serum-supplementierten TSB, jedoch nicht zu einem kompletten Verlust der Fähigkeit zur Biofilmbildung führte. Eine verminderte intrazelluläre Adhäsion schien dem nicht zugrunde zu liegen, da beide Stämme in der Lage waren in Gegenwart von 50 % Ziegenserum  zu aggregieren. S. epidermidis 1585-M66 zeigte jedoch in Gegenwart der Antibiotika Vancomycin und Daptomycin eine deutlich verminderte MHK gegenüber 1585, wie auch ein verzögertes Wachstum, was sich in einer verlängerten lag-Phase äußerte. Diese Beobachtungen geben Hinweise darauf, dass Srr im Verlauf der Peptidoglykan- und Zellwandsynthese eine Rolle spielen könnte.

So könnte Srr durch Bereitstellung von PLP die Aktivität der PLP-abhängigen Alanin-Racemase beeinflussen und somit an der Synthese des D-Alanins des Peptidoglykangerüsts  mitwirken. Diese Veränderungen könnten einen pleiotropen Einfluss auf Aggregation wie auch Adhärenz haben und den veränderten Biofilmphänotyp erklären.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass in dieser Arbeit erstmals eine Determinante der Serum-abhängigen S. epidermidis Biofilmbildung dargestellt werden konnte. Der Einfluss des Vitamin B6-Metabolismus auf die S. epidermidis Biofilmbildung wurde bislang noch nicht dokumentiert. Der Befund ist von erheblicher Bedeutung, denn die Beeinflussung dieses Stoffwechselweges könnte einen neuartigen Ansatz in der Therapie Fremdmaterial-assoziierter S. epidermidis Infektionen darstellen.

 

abstract (englisch)

Staphylococcus epidermidis belongs to the group of coagulase-negative Staphylococci. This species is a commensal bacterium which colonizes skin and mucosa of humans and animals. But in the context of the use of medical devices like artificial joints, heart valves or intravascular catheters, S. epidermidis develops pathogenicity and is co-responsible for the increasing amount of device related infections. This is particularly caused by the ability of S. epidermidis to form so called biofilms on abiotic and biotic surfaces. Former experiments determined the biofilm phenotype especially under artificial conditions. However, this procedure reflects only partially the conditions in vivo and it is known that clinical S. epidermidis isolates exist whose biofilm phenotype differs depending on culture conditions. For example the clinical isolate S. epidermidis 1585 possesses in the presence of an artificial medium (TSB) a biofilm negative phenotype but through approaching to in vivo like conditions by supplementing goat serum, a biofilm positive phenotype could be induced. Under this aspect transposon mutants of S. epidermidis 1585 resulting from an earlier transposon mutagenesis which had lost the ability to form serum dependent biofilms got further characterized. To ensure that the observed phenotype change was a consequence of the transposon mutagenesis and was not related to secondary genetic events, the chromosomal Tn917 insertion was transduced by phage transduction into the wildtype S. epidermidis 1585. Additionally an in trans complementation of the inactivated gene locus was performed to rule out polar effects of the transposon insertion. In trans complementation lead to a restoration of the phenotype from S. epidermidis 1585 in the transductant 1585-M66. Genetic analysis revealed that in 1585-M66 Tn917 was inserted into an open reading frame encoding for a pdxR-Homolog, called srr (serum response regulator). Srr encodes for a 454 amino acid protein which exhibits a C-terminal helix-turn-helix (HTH) domain and a N-terminal domain which shows similarities with the super family of pyridoxal-5'-phosphate (PLP)-dependent aspartat aminotransferases. Consequently Srr could be classified into the family of the GntR-like transcription factors and within that into the MocR-subfamily. Transcriptional analysis demonstrated that Srr is a positive regulator of adjacent open readings frames SERP0158 und SERP0159 which show homologies with pdxS and pdxT, respectively. PdxS und PdxT are known to be involved into the deoxyxylulose 5-phosphate (DXP)-independent vitamin B6 biosynthesis pathway. The only active form of vitamin B6, pyridoxal-5'-phosphate (PLP) acts as an important cofactor in many prokaryotic enzymes and is among others involved in the amino acid metabolism. By comparing the wildtype S. epidermidis 1585 with 1585-M66 it could be shown that inactivation of srr induced a reduced biofilm forming capability in serum-complemented TSB, but not to a complete abolishment of the ability to form a biofilm. This phenotype did not seem to relate to reduced intracellular adhesion since both strains were able to aggregate in the presence of 50 % goat serum. Intriguingly, in contrast to 1585, S. epidermidis 1585-M66 exhibited decreased MICs to cell wall active antibiotics vancomycin and daptomycin, and a delayed growth with a prolongated lag phase. These studies give a hint that Srr might play a role in the course of the peptidoglycan and cell wall biosynthesis. It appears plausible to assume that Srr affects the activity of the PLP dependent Alanine racemase by providing PLP and as a consequence contributes to the synthesis of D-Alanine of the peptidoglycan scaffold. These changes might have pleiotropic effects on aggregation as well as on adhesion and in this way explain the altered phenotype.          
In conclusion, this work for the first time describes a determinant of serum dependent S. epidermidis biofilm formation. The impact of the vitamin B6 metabolism on the biofilm formation of S. epidermidis has not been documented so far. These findings are of general importance because the interference of this pathway might offer innovative approaches for the therapy of device-related infections.

keywords

Staphylococcus epidermidis, Biofilmbildung, Serum, Staphylococcus epidermidis, biofilm formation, serum

kb

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