Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Sebastian Werneburg

Identification, dynamic regulation and putative

functions of polysialylated proteins in oligodendrocyte

precursors and microglia

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107023

title (ger.)

Identifikation, dynamische Regulation und potentielle Funktionen polysialylierter Proteine in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und Mikroglia

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/werneburgs_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Polysialinsäure (PolySia) ist ein entscheidender Modulator der Migration und Differenzierung von Vorläuferzellen und dementsprechend eng mit der neuralen Entwicklung und Plastizität verknüpft. Der Hauptträger von PolySia im Vertebratengehirn ist das neurale Zelladhäsionsmolekül NCAM. Die Synthese von PolySia wird durch die beiden Polysialyltransferasen (PolySTs) ST8SIA2 und ST8SIA4 katalysiert. Aufgrund der ausgeprägten Akzeptorspezifität beider Enzyme wurden bislang nur wenige weitere polysialylierte Trägermoleküle identifiziert. Eines davon, das synaptische Zelladhäsionsmolekül SynCAM 1, wurde im perinatalen Mausgehirn beschrieben. Die Funktionen, die zelluläre Verteilung und die subzelluläre Lokalisation von PolySia-SynCAM 1, sowie dessen Existenz im Menschen blieben bislang jedoch ungeklärt.

In der ersten Studie der vorliegenden Doktorarbeit konnte unter Verwendung muriner Gliakulturen gezeigt werden, dass PolySia-SynCAM 1 eine Subpopulation von NCAM-negativen Zellen innerhalb der heterogenen Gruppe der NG2 exprimierenden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) definiert. In diesen Zellen ist PolySia ausschließlich an N-Glykane geknüpft. Die Analyse von Primärkulturen aus Mäusen, denen NCAM und jeweils eine der beiden PolySTs fehlte, zeigte, dass PolySia auf SynCAM 1 ausschließlich von ST8SIA2 synthetisiert wird. Für die zweite Studie der Doktorarbeit wurden humane embryonale Stammzellen gezielt zu OPCs differenziert. Diese OPC-Kulturen ermöglichten es, SynCAM 1 als neues Trägerprotein für PolySia im Menschen zu identifizieren. Zudem zeigte die Studie, dass - im Gegensatz zu murinen OPCs - alle humanen OPCs PolySia auf den NCAM-Isoformen 140 und 180 co-exprimierten. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass während der abschließenden Differenzierung von OPCs zu MBP-positiven Oligodendrozyten PolySia auf beiden Trägermolekülen herabreguliert wird.

In der ersten Studie konnte zudem in allen Ncam-/- Mikroglia durch ST8SIA4 synthetisierte PolySia auf O-Glykanen nachgewiesen werden. Dies deutete auf die Existenz eines weiteren PolySia-Trägers in diesen Zellen hin. Tatsächlich handelte es sich bei diesem PolySia-Trägermolekül um Neuropilin-2 (NRP2). Polysialyliertes NRP2 wurde zuvor ausschließlich auf der Zelloberfläche von dendritschen Zellen und exudaten Makrophagen beschrieben. Vor kurzem wurde die Differenzierung von Mikroglia aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSdM) etabliert. Die Verwendung dieser Zellen ermöglichte es, in der dritten Studie der vorliegenden Doktorarbeit die Polysialylierung von Mikroglia weitergehend zu untersuchen. Im Gegensatz zu primären murinen Mikroglia, welche aus dem Gehirn abgeleitet wurden, waren alle iPSdM NCAM-negativ. Es konnte gezeigt werden, dass diese Zellen PolySia auf NRP2, sowie auf E‑Selektin Ligand-1 (ESL-1) präsentieren. ESL-1 wurde in der aktuellen Studie als neuer, zuvor unbekannter Träger für PolySia identifiziert.

Die Kombination der drei Studien dieser Doktorarbeit zeigt, dass alle polysialylierten Proteine in NCAM-negativen OPCs, murinen Mikroglia aus NCAM knockout-Mäusen und iPSdM strikt innerhalb des Golgi‑Apparates zurückgehalten werden. Bemerkenswerterweise konnte die PolySia in allen drei Zelltypen dynamisch umgeordnet werden. In OPCs erfolgte dies als Antwort auf Depolarisation, während eine Umorganisation von PolySia in Mikroglia als Antwort auf LPS-induzierte pro-inflammatorische Aktivierung zu beobachten war. In allen Zellen erfolgte zunächst eine rasche Translokation von PolySia aus dem Golgi auf die Zelloberfläche, worauf sich eine vollständige Depletion von PolySia anschloss. Eine mögliche Rolle dieser dynamischen PolySia Translokation in OPCs während der beginnenden Myelinisierung wird in der vorliegenden Arbeit diskutiert. Im Falle der iPSdM konnte nach LPS-Induktion polysialyliertes NRP2 und ESL-1 im Zellkulturmedium nachgewiesen werden. Vermittelt wurde diese Ausschüttung vermutlich durch ectodomain shedding, da eine Inhibition von Metalloproteinasen teilweise verhinderte, dass polysialylierte Proteine in das Zellkulturüberstand ausgeschüttet wurden. Schlussendlich konnte gezeigt werden, dass lösliche PolySia im Zellkulturmedium die Stickstoffmonoxid-Produktion von LPS-aktivierten primären murinen Mikroglia und iPSdM verringerte. Diese Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass ausgeschüttetes polysialyliertes NRP2 und ESL-1 eine Rolle in einem negativen Rückkopplungsmechanismus im Zuge der LPS-induzierten pro-inflammatorischen Aktivierung der Mikroglia spielen.

abstract (englisch)

The glycan polysialic acid (polySia) is a prominent modulator of precursor cell migration and differentiation, and tightly associated with neural development and plasticity. The neural cell adhesion molecule NCAM is the major polySia carrier in the vertebrate brain. PolySia synthesis is mediated by the two polysialyltransferases (polySTs) ST8SIA2 and ST8SIA4, which display high acceptor specificity. Consequently, only few other polysialylated proteins have been identified, among them the synaptic cell adhesion molecule SynCAM 1 in the perinatal mouse brain. However, functional implications, cellular distribution and subcellular localization of polySia-SynCAM 1, as well as its existence in humans, remained unknown.

Using murine glial cultures, the first study of this thesis demonstrates that polySia-SynCAM 1 defines a subset of NCAM-negative cells within the heterogeneous pool of brain-resident NG2 expressing oligodendrocyte precursor cells (OPCs). In these cells, polySia is attached to N‑glycans, and analyses of cultures derived from mice lacking NCAM and either one of the two polySTs revealed that polySia on SynCAM 1 is exclusively synthesized by ST8SIA2. By directed differentiation of human embryonic stem cells into OPCs, the second study of this thesis identifies SynCAM 1 as a novel polySia carrier in humans. Moreover, in contrast to murine OPCs, all human progenitors co-express polySia on NCAM isoforms 140 and 180. During terminal differentiation into myelin basic protein-positive oligodendrocytes polySia on both carriers was down-regulated.

An additional result of the first study was the detection of ST8SIA4-synthesized polySia on O‑glycans in all Ncam-/- microglia, the innate immune cells of the brain. This indicates the existence of another polySia carrier in these cells. The carrier was identified to be neuropilin‑2 (NRP2), so far polysialylated NRP2 was only known to occur on dendritic cells and exudate macrophages outside the brain. Using newly established induced pluripotent stem cell-derived microglia (iPSdM) the third study further explored the polysialylation of microglia. Unlike cultured microglia derived from postnatal mouse brain, iPSdM are negative for NCAM, but express polySia on NRP2, as well as on E-selectin ligand-1 (ESL-1), which was identified as a novel, so far unknown polySia carrier in the current study.

Together, the studies of this thesis reveal that all polysialylated proteins in NCAM-negative OPCs, murine microglia from NCAM knockout mice and iPSdM are strictly confined to the Golgi. Even more remarkably, polySia in all three cell-types can be dynamically rearranged. In response to depolarization of OPCs and LPS-induced pro-inflammatory activation of microglia, polySia is rapidly translocated to the cell surface and then completely depleted. A possible role of the dynamic polySia rearrangement in OPCs during the onset of myelination is discussed. In iPSdM, polysialylated NRP2 and ESL-1 are released into the cell culture medium, whereas polySia is retained upon metalloproteinase inhibition, indicating ectodomain shedding. Soluble polySia attenuates the production of nitric oxide after LPS-induced activation of murine brain-derived microglia and iPSdM. These data strongly argue for a role of polysialylated NRP2 and ESL-1 in negative feedback regulation of LPS-induced microglia activation.

keywords

PSA-NCAM, NG2 Glia, Proteinglykosylierung, PSA-NCAM, NG2 glia, protein glycosylation 

kb

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